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本来对的colony PCR 又不对了
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菜鸟一枚，第一次发帖，焦头烂额中，还望各路大仙多指教。 两个外源基因连在质粒上，在酿酒酵母中表达，测了序做转化，去年10月做出来了正确的colony PCR结果，1月末western结果也对，现在开始准备样品跑仪器，怀疑菌长的不太对，想验证一下，放了半年的旧平板colony PCR结果不对（western做出正确的结果就是从这个板上挑的），之前保留的菌液划平板再做colony PCR结果还是不对。之前正确的结果是一千多bp，现在整整齐齐的都是五六百的样子，搞不明白了就。。。。。。  迷茫中，求助啊求助，求指点。 |
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2楼2012-04-30 10:40:18
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
conanlp: 金币+10, ★★★很有帮助 2012-05-04 09:44:30
感谢参与，应助指数 +1
conanlp: 金币+10, ★★★很有帮助 2012-05-04 09:44:30
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可能性之1： 之前的colony PCR 和western都是假阳性， 但是你说侧过序， 测通了插入片段的全长吗？没有的话回去检查一下测序结果。 可能性之2：平板放的时间太长了，发生突变的可能性很大。 但是保存的菌种也不对，你是多久之后保存的？ 如果是挑完克隆之后马上保存菌种的话，我觉得可能是你这次的PCR引物用错了。 可能性之3： 你检查一下你的插入片段或者载体里面是不是有长重复序列，如果有，可能是重复序列之间发生了同源重组，导致丢了一段DNA，这也能解释为什么现在的colony PCR产物变小了。 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
3楼2012-04-30 19:33:06
jimmy7633
木虫 (著名写手)
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4楼2012-04-30 19:34:23
送鲜花一朵 |
回复了这么多，多谢多谢！！！你的回复让我仔仔细细把实验记录又看了一遍。 可能性之1：测序确实不是全长，用的基因是一个公司合成的买的不是提的，测序结果是酶切位点附近的正向和逆向的，结果有个别不一样的碱基但还是可以的。这一步估计问题不大。 可能性之2：放了半年的确实不可信。 我的实验涉及到两个外源基因，所以当时是转化后做colony PCR同时划板备份，结果不对的排除掉，再做第二个colony PCR也划板备份看结果，选出来对的做western。回头看看结果估计有可能是这一步的问题。 可能性之3：这个得再仔细看看了。 目前重新设计的引物再试试，也决定重做转化了，实验方案调整了一些工作量倒也还好。多谢您，和高手交流受益匪浅。  |
5楼2012-05-03 17:58:03
6楼2012-05-03 17:59:11
wurenzhi0721
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7楼2012-08-14 21:00:59
50