【答案】应助回帖

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1楼2012-04-29 20:24:29

kennyhas

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【答案】应助回帖

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conanlp: 金币+10, ★★★很有帮助 2012-05-04 09:44:30

可能性之1：之前的colony PCR 和western都是假阳性，但是你说侧过序，测通了插入片段的全长吗？没有的话回去检查一下测序结果。

可能性之2：平板放的时间太长了，发生突变的可能性很大。但是保存的菌种也不对，你是多久之后保存的？如果是挑完克隆之后马上保存菌种的话，我觉得可能是你这次的PCR引物用错了。

可能性之3：你检查一下你的插入片段或者载体里面是不是有长重复序列，如果有，可能是重复序列之间发生了同源重组，导致丢了一段DNA，这也能解释为什么现在的colony PCR产物变小了。

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conanlp

3楼2012-04-30 19:33:06

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conanlp

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2楼2012-04-30 10:40:18

jimmy7633

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conanlp

4楼2012-04-30 19:34:23

conanlp

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引用回帖:

3楼: Originally posted by kennyhas at 2012-04-30 19:33:06:
可能性之1：之前的colony PCR 和western都是假阳性，但是你说侧过序，测通了插入片段的全长吗？没有的话回去检查一下测序结果。

可能性之2：平板放的时间太长了，发生突变的可能性很大。但是保存的菌种也不 ...

回复了这么多，多谢多谢！！！你的回复让我仔仔细细把实验记录又看了一遍。

可能性之1：测序确实不是全长，用的基因是一个公司合成的买的不是提的，测序结果是酶切位点附近的正向和逆向的，结果有个别不一样的碱基但还是可以的。这一步估计问题不大。

可能性之2：放了半年的确实不可信。
我的实验涉及到两个外源基因，所以当时是转化后做colony PCR同时划板备份，结果不对的排除掉，再做第二个colony PCR也划板备份看结果，选出来对的做western。回头看看结果估计有可能是这一步的问题。

可能性之3：这个得再仔细看看了。

目前重新设计的引物再试试，也决定重做转化了，实验方案调整了一些工作量倒也还好。多谢您，和高手交流受益匪浅。

5楼2012-05-03 17:58:03