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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 定量pcr标曲
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消锦lzhy

新虫 (初入文坛)

[求助] 定量pcr标曲

请教各位虫友：我之前做定量pcr（sybr green法）标准曲线，由于引物二聚体比较严重，10的5次方拷贝数以下就不准确了，现在考虑换一对新的引物，但是试着做了一下，也有个很严重的问题，就是所有的标准品Ct值几乎一样，我是做了梯度稀释，从10的2次方到10的八次方，不过没有非特异性产物，不知什么原因。我在想是不是需要重新做标准品呢？因为原来的标准品是用原来那个400bp左右的引物的pcr产物做克隆再提取质粒得到的，现在想换一对200bp左右的引物，需要重新做标准品吗吗？（注：我用新的引物试着扩增了一下原标准品，也有比较清晰的条带）
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1楼 2012-04-21 23:51:12
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-04-22 14:15:59
首先考虑是你的稀释方式原因吧。可能方式不对。其次做下NTC，如果无酶水被污染了，每个样品的Ct值是一样，同时稀释倍数越高Ct值稍稍增加。最后，再考虑下是你的标准品的问题吧。祝楼主实验顺利
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2楼2012-04-22 09:50:34
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cheng_xiao

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 确实 2012-04-22 19:16:05
你还是用新的引物吧，扩增400多bp太大，一般就100bp多，引物是实验好坏一大关键因素， 我觉得是这样，实验顺利啊
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我努力我奋斗我成功
3楼2012-04-22 10:25:16
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消锦lzhy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-04-22 09:50:34:
首先考虑是你的稀释方式原因吧。可能方式不对。其次做下NTC，如果无酶水被污染了，每个样品的Ct值是一样，同时稀释倍数越高Ct值稍稍增加。最后，再考虑下是你的标准品的问题吧。祝楼主实验顺利

灰常感谢~不过我想污染的问题和稀释的问题不存在，因为用同样的标准品和试剂，用400bp的引物做的时候不存在污染，而且Ct值也有差异，就是不太明白如果要换引物标准品是不是也要相应的换？
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4楼2012-04-22 14:47:22
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消锦lzhy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cheng_xiao at 2012-04-22 10:25:16:
你还是用新的引物吧，扩增400多bp太大，一般就100bp多，引物是实验好坏一大关键因素， 我觉得是这样，实验顺利啊

灰常感谢~我的引物是打算要换了，只是不知道标准品是不是也要相应的换，我是这样理解的：原来引物扩增的片段（400bp）如果包含了新引物扩增的片段（200bp）就可以不换，没包含就需要换。我这两条引物的position分别是：前引91–116，后引481–506（400bp）和前引211–231，后引393–416（200bp），可以看出200bp的是包含在400bp的片段中的吗？（以前没学过生物，对基本的原理不是很清楚），所以我就就用原来的标准品试着做了一下，是有特异性产物，但Ct值又无梯度，很纳闷，我不知道是不是我对引物的理解有误，还是200bp这对引物本身有问题。
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5楼2012-04-22 15:07:43
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cheng_xiao

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

这样的话，是不是你的引物特异性不高啊，或者你试验中老有污染啊，建议你做一个隐性对照看一下
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我努力我奋斗我成功
6楼2012-04-22 15:30:13
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消锦lzhy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cheng_xiao at 2012-04-22 15:30:13:
这样的话，是不是你的引物特异性不高啊，或者你试验中老有污染啊，建议你做一个隐性对照看一下

恩，好的，谢谢
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7楼2012-04-22 16:35:59
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