应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 定量pcr标曲
71/1返回列表
查看: 1396  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

消锦lzhy

新虫 (初入文坛)

[求助] 定量pcr标曲

请教各位虫友：我之前做定量pcr（sybr green法）标准曲线，由于引物二聚体比较严重，10的5次方拷贝数以下就不准确了，现在考虑换一对新的引物，但是试着做了一下，也有个很严重的问题，就是所有的标准品Ct值几乎一样，我是做了梯度稀释，从10的2次方到10的八次方，不过没有非特异性产物，不知什么原因。我在想是不是需要重新做标准品呢？因为原来的标准品是用原来那个400bp左右的引物的pcr产物做克隆再提取质粒得到的，现在想换一对200bp左右的引物，需要重新做标准品吗吗？（注：我用新的引物试着扩增了一下原标准品，也有比较清晰的条带）
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-04-21 23:51:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-04-22 14:15:59
首先考虑是你的稀释方式原因吧。可能方式不对。其次做下NTC，如果无酶水被污染了，每个样品的Ct值是一样，同时稀释倍数越高Ct值稍稍增加。最后，再考虑下是你的标准品的问题吧。祝楼主实验顺利
赞一下 回复此楼
2楼2012-04-22 09:50:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cheng_xiao

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 确实 2012-04-22 19:16:05
你还是用新的引物吧，扩增400多bp太大，一般就100bp多，引物是实验好坏一大关键因素， 我觉得是这样，实验顺利啊
赞一下 回复此楼
我努力我奋斗我成功
3楼2012-04-22 10:25:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

消锦lzhy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-04-22 09:50:34:
首先考虑是你的稀释方式原因吧。可能方式不对。其次做下NTC，如果无酶水被污染了，每个样品的Ct值是一样，同时稀释倍数越高Ct值稍稍增加。最后，再考虑下是你的标准品的问题吧。祝楼主实验顺利

灰常感谢~不过我想污染的问题和稀释的问题不存在，因为用同样的标准品和试剂，用400bp的引物做的时候不存在污染，而且Ct值也有差异，就是不太明白如果要换引物标准品是不是也要相应的换？
赞一下 回复此楼
4楼2012-04-22 14:47:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

消锦lzhy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cheng_xiao at 2012-04-22 10:25:16:
你还是用新的引物吧，扩增400多bp太大，一般就100bp多，引物是实验好坏一大关键因素， 我觉得是这样，实验顺利啊

灰常感谢~我的引物是打算要换了，只是不知道标准品是不是也要相应的换，我是这样理解的：原来引物扩增的片段（400bp）如果包含了新引物扩增的片段（200bp）就可以不换，没包含就需要换。我这两条引物的position分别是：前引91–116，后引481–506（400bp）和前引211–231，后引393–416（200bp），可以看出200bp的是包含在400bp的片段中的吗？（以前没学过生物，对基本的原理不是很清楚），所以我就就用原来的标准品试着做了一下，是有特异性产物，但Ct值又无梯度，很纳闷，我不知道是不是我对引物的理解有误，还是200bp这对引物本身有问题。
赞一下 回复此楼
5楼2012-04-22 15:07:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cheng_xiao

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

这样的话，是不是你的引物特异性不高啊，或者你试验中老有污染啊，建议你做一个隐性对照看一下
赞一下 回复此楼
我努力我奋斗我成功
6楼2012-04-22 15:30:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

消锦lzhy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cheng_xiao at 2012-04-22 15:30:13:
这样的话，是不是你的引物特异性不高啊，或者你试验中老有污染啊，建议你做一个隐性对照看一下

恩，好的，谢谢
回复此楼
7楼2012-04-22 16:35:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 消锦lzhy 的主题更新
71/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿西安交通大学材料工程专业 282分求调剂 +11 枫桥ZL 2026-03-18 13/650 2026-03-22 20:26 by edmund7
[考研] 328求调剂，英语六级551，有科研经历 +6 生物工程调剂 2026-03-17 10/500 2026-03-22 20:22 by edmund7
[考研] 一志愿中南大学化学学硕0703总分337求调剂 +3 niko- 2026-03-22 3/150 2026-03-22 15:15 by 杨杨杨紫
[考研] 303求调剂 +5 安忆灵 2026-03-22 6/300 2026-03-22 12:46 by 素颜倾城1988
[考研] 354求调剂 +7 Tyoumou 2026-03-18 10/500 2026-03-22 11:11 by 人来盛
[考研] 一志愿南大，0703化学，分数336，求调剂 +3 收到VS 2026-03-21 3/150 2026-03-21 18:42 by 学员8dgXkO
[考研] 296求调剂 +4 www_q 2026-03-20 4/200 2026-03-21 17:26 by 学员8dgXkO
[考研] 求调剂 +6 Mqqqqqq 2026-03-19 6/300 2026-03-21 08:04 by JourneyLucky
[考研] 316求调剂 +6 梁茜雯 2026-03-19 6/300 2026-03-21 06:32 by Ecowxq666！
[考研] 265求调剂 +3 Jack?k?y 2026-03-17 3/150 2026-03-21 03:17 by JourneyLucky
[考研] 一志愿中国石油大学（华东） 本科齐鲁工业大学 +3 石能伟 2026-03-17 3/150 2026-03-21 02:22 by JourneyLucky
[考研] 308求调剂 +3 阿姐阿姐家啊 2026-03-18 3/150 2026-03-20 23:24 by JourneyLucky
[考研] 求调剂，一志愿:南京航空航天大学大学 ，080500材料科学与工程学硕，总分289分 +4 @taotao 2026-03-19 4/200 2026-03-20 22:14 by JourneyLucky
[考研] 329求调剂 +9 想上学吖吖 2026-03-19 9/450 2026-03-20 22:01 by luoyongfeng
[考研] A区线材料学调剂 +5 周周无极 2026-03-20 5/250 2026-03-20 21:33 by laoshidan
[论文投稿] 申请回稿延期一个月，编辑同意了。但系统上的时间没变，给编辑又写邮件了，没回复 10+3 wangf9518 2026-03-17 4/200 2026-03-19 23:55 by babero
[考研] 085600材料与化工调剂 324分 +10 llllkkkhh 2026-03-18 12/600 2026-03-19 14:33 by llllkkkhh
[考研] 286求调剂 +6 lemonzzn 2026-03-16 10/500 2026-03-19 14:31 by lemonzzn
[考研] 0703化学调剂 +3 妮妮ninicgb 2026-03-17 3/150 2026-03-18 10:29 by macy2011
[考博] 26申博 +4 八6八68 2026-03-16 4/200 2026-03-17 13:00 by 轻松不少随
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭