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jennyxyz219

新虫 (初入文坛)

[求助] 标准菌株建立荧光定量PCR的标准曲线

现在实验进展到需要对混合的DNA进行某种细菌的定量，但是定量前涉及到要进行标准曲线的构建，因为实验室里也没有人做过该方面的，所以想问问各位，应该如何构建呢？
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1楼 2011-07-23 09:55:31
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
jennyxyz219(金币+2): 有帮助 2011-07-24 14:54:37
dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-07-25 08:14:58
既然要对某一种细菌进行定量，那标准曲线的模板一定是这种细菌的DNA；并且以定要先对标准品进行精确定量，比如你要知道他的精确浓度或者拷贝数，然后做梯度稀释。如果是要为了发文章，你还要先做一个干扰物测定实验，用相同量的混合DNA与不加这种菌的DNA做定量，看有没有干扰物来影响结果
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2楼2011-07-24 11:15:11
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jennyxyz219

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2011-07-24 11:15:11:
既然要对某一种细菌进行定量，那标准曲线的模板一定是这种细菌的DNA；并且以定要先对标准品进行精确定量，比如你要知道他的精确浓度或者拷贝数，然后做梯度稀释。如果是要为了发文章，你还要先做一个干扰物测定实 ...

那么我想请问下，
问题一：我现在有大肠杆菌的标准菌株ATCC25922，我可以通过摇菌增殖，然后提取里面的DNA，再用分光光度计来检测它的浓度，可是我要该怎么来确定它的拷贝数呢，它的浓度和拷贝数之间有没有公式进行换算的呢？  
问题二：我看很过荧光定量PCR进行绝对定量的时候是要求建立标准曲线，而这个标准曲线是通过将目标序列整合到质粒进去，然后通过提取质粒的DNA，在进行浓度和拷贝数的转换，那么我这个是否也需要构建质粒，然后提取质粒，然后再进行标准曲线构建呢？
希望能够给我回复，我因为这个问题，已经困扰了很久了！谢谢您的帮助
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3楼2011-07-24 14:59:15
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
dhd997(金币+3): 鼓励交流 2011-07-25 08:15:10
我是这么理解的，你看有没有道理：基因组DNA的拷贝数基本是算不出来的（基因组太大了），你只能测出它的浓度。所以要建立标准曲线的话只能采用你说的第二个问题中的方案：把你的要扩增片段放到质粒里面去，并且有一点是确定的，重组质粒的浓度和拷贝数之间是可以换算的，这样通过对模板进行精确定量后就可以倍比稀释来做标准曲线了
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4楼2011-07-24 15:13:32
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jennyxyz219

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2011-07-24 15:13:32:
我是这么理解的，你看有没有道理：基因组DNA的拷贝数基本是算不出来的（基因组太大了），你只能测出它的浓度。所以要建立标准曲线的话只能采用你说的第二个问题中的方案：把你的要扩增片段放到质粒里面去，并且有 ...

你说的确实是有道理的，我想应该是需要构建质粒的吧！多谢您的答复！
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5楼2011-07-24 20:40:27
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by jennyxyz219 at 2011-07-24 20:40:27:
你说的确实是有道理的，我想应该是需要构建质粒的吧！多谢您的答复！

客气，祝你实验顺利！
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6楼2011-07-24 21:43:04
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