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jennyxyz219

新虫 (初入文坛)

[求助] 标准菌株建立荧光定量PCR的标准曲线

现在实验进展到需要对混合的DNA进行某种细菌的定量,但是定量前涉及到要进行标准曲线的构建,因为实验室里也没有人做过该方面的,所以想问问各位,应该如何构建呢?
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jennyxyz219

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2011-07-24 15:13:32:
我是这么理解的,你看有没有道理:基因组DNA的拷贝数基本是算不出来的(基因组太大了),你只能测出它的浓度。所以要建立标准曲线的话只能采用你说的第二个问题中的方案:把你的要扩增片段放到质粒里面去,并且有 ...

你说的确实是有道理的,我想应该是需要构建质粒的吧!多谢您的答复!
5楼2011-07-24 20:40:27
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
jennyxyz219(金币+2): 有帮助 2011-07-24 14:54:37
dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-07-25 08:14:58
既然要对某一种细菌进行定量,那标准曲线的模板一定是这种细菌的DNA;并且以定要先对标准品进行精确定量,比如你要知道他的精确浓度或者拷贝数,然后做梯度稀释。如果是要为了发文章,你还要先做一个干扰物测定实验,用相同量的混合DNA与不加这种菌的DNA做定量,看有没有干扰物来影响结果
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
2楼2011-07-24 11:15:11
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jennyxyz219

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2011-07-24 11:15:11:
既然要对某一种细菌进行定量,那标准曲线的模板一定是这种细菌的DNA;并且以定要先对标准品进行精确定量,比如你要知道他的精确浓度或者拷贝数,然后做梯度稀释。如果是要为了发文章,你还要先做一个干扰物测定实 ...

那么我想请问下,
问题一:我现在有大肠杆菌的标准菌株ATCC25922,我可以通过摇菌增殖,然后提取里面的DNA,再用分光光度计来检测它的浓度,可是我要该怎么来确定它的拷贝数呢,它的浓度和拷贝数之间有没有公式进行换算的呢?  
问题二:我看很过荧光定量PCR进行绝对定量的时候是要求建立标准曲线,而这个标准曲线是通过将目标序列整合到质粒进去,然后通过提取质粒的DNA,在进行浓度和拷贝数的转换,那么我这个是否也需要构建质粒,然后提取质粒,然后再进行标准曲线构建呢?
希望能够给我回复,我因为这个问题,已经困扰了很久了!谢谢您的帮助
3楼2011-07-24 14:59:15
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

★ ★ ★
dhd997(金币+3): 鼓励交流 2011-07-25 08:15:10
我是这么理解的,你看有没有道理:基因组DNA的拷贝数基本是算不出来的(基因组太大了),你只能测出它的浓度。所以要建立标准曲线的话只能采用你说的第二个问题中的方案:把你的要扩增片段放到质粒里面去,并且有一点是确定的,重组质粒的浓度和拷贝数之间是可以换算的,这样通过对模板进行精确定量后就可以倍比稀释来做标准曲线了
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
4楼2011-07-24 15:13:32
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