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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】荧光定量PCR？
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Axililiy

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】荧光定量PCR？ 已有7人参与

我做的荧光定量PCR,现在存在以下几个问题：
1、熔出曲线出峰的位置有点小，在78.5的位置上，我看好多文献上多都在85左右，我想问问：我这个是我的主峰嘛?会不会是引物二聚体，或者是比较小的非特异扩增啊？（我把跑出来的样品点板，我的产物163bp，和阴性对比，我也看不出来是不是我要的产物）
2、阴性也超高，所以我怀疑是不是我P出来的不是我要的产物啊？
3、其次就是做的标准曲线，分不开，低浓度的基本上都是同时出峰，这是什么原因引起的？
如下图：
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1楼 2010-09-07 19:16:30
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lstt09nk

铁杆木虫 (职业作家)

小堂
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
眼看帖子沉了，帮顶
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坚持能无数次改变人生的风景，因为只要路是对的，就不怕远~~~
2楼2010-09-08 09:17:45
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onkelhero

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
没做过 想做  路过
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3楼2010-09-08 10:09:40
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mafang68

金虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
从你的溶解曲线看，引物的特异性不太好；
还有你的样品浓度太高，起峰在15-20个循环最好
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木虫啦，哈哈
4楼2010-09-08 10:15:38
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yuyixst

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你说你阴性超高是什么意思，是阴性也有扩增么，还有，如果你低浓度的也分不开，再加上你说的假阳性，那我可以肯定你是污染了
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5楼2010-09-08 10:21:53
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芥末蚕豆

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by mafang68 at 2010-09-08 10:15:38:
从你的溶解曲线看，引物的特异性不太好；
还有你的样品浓度太高，起峰在15-20个循环最好

我现在觉得不像是污染了，感觉好像是引物二聚体和产物分不开；或者是压根就是引物二聚体。这就是上面图里的阴性
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开心就好！
6楼2010-09-08 10:29:10
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jasco

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
先做个普通pcr电泳看看扩增条带咋样
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7楼2010-09-08 13:55:41
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)

合伙创业版兼职版主

优秀版主
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1，不管你的样本结果怎么样，只要阴性有峰，这个实验就不可信，要全盘否定

2，再做实验，确实是你的引物问题了 就换引物，否则不能排除是污染了模板

3，标准曲线，至少也要5个点，3重复，CT值太小了影响判断
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8楼2010-09-08 14:07:10
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