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Axililiy

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】荧光定量PCR? 已有7人参与

我做的荧光定量PCR,现在存在以下几个问题:
1、熔出曲线出峰的位置有点小,在78.5的位置上,我看好多文献上多都在85左右,我想问问:我这个是我的主峰嘛?会不会是引物二聚体,或者是比较小的非特异扩增啊?(我把跑出来的样品点板,我的产物163bp,和阴性对比,我也看不出来是不是我要的产物)
2、阴性也超高,所以我怀疑是不是我P出来的不是我要的产物啊?
3、其次就是做的标准曲线,分不开,低浓度的基本上都是同时出峰,这是什么原因引起的?
如下图:

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lstt09nk

铁杆木虫 (职业作家)

小堂


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
眼看帖子沉了,帮顶
坚持能无数次改变人生的风景,因为只要路是对的,就不怕远~~~
2楼2010-09-08 09:17:45
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onkelhero

木虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
没做过 想做  路过
3楼2010-09-08 10:09:40
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mafang68

金虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
从你的溶解曲线看,引物的特异性不太好;
还有你的样品浓度太高,起峰在15-20个循环最好
木虫啦,哈哈
4楼2010-09-08 10:15:38
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yuyixst

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
你说你阴性超高是什么意思,是阴性也有扩增么,还有,如果你低浓度的也分不开,再加上你说的假阳性,那我可以肯定你是污染了
5楼2010-09-08 10:21:53
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芥末蚕豆

铜虫 (初入文坛)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by mafang68 at 2010-09-08 10:15:38:
从你的溶解曲线看,引物的特异性不太好;
还有你的样品浓度太高,起峰在15-20个循环最好

我现在觉得不像是污染了,感觉好像是引物二聚体和产物分不开;或者是压根就是引物二聚体。这就是上面图里的阴性
开心就好!
6楼2010-09-08 10:29:10
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jasco

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
先做个普通pcr电泳看看扩增条带咋样
7楼2010-09-08 13:55:41
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)

合伙创业版兼职版主

优秀版主


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
1,不管你的样本结果怎么样,只要阴性有峰,这个实验就不可信,要全盘否定

2,再做实验,确实是你的引物问题了 就换引物,否则不能排除是污染了模板

3,标准曲线,至少也要5个点,3重复,CT值太小了影响判断
8楼2010-09-08 14:07:10
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