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荧光定量PCR的扩增曲线很奇怪，什么原因已有2人参与
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第一次做荧光定量PCR，得到的扩增曲线很奇怪，不知道是什么原因，求指教！还有要是CT值过高是不是应该增加模板的浓度啊？  |
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 核酸生物学实验经验 | 【分子生物】EPI帖 | 观-精-记 |
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atlanticwi
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【答案】应助回帖
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西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 最近很犀利啊~Real-time产物跑胶是可行的，我自己也做过，嘿嘿~ 2012-03-28 11:12:13
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 最近很犀利啊~Real-time产物跑胶是可行的，我自己也做过，嘿嘿~ 2012-03-28 11:12:13
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嗯..... 个人看法： 为什么大家把溶解曲线看的这么重要呢，我觉得本末倒置了，若是你的扩增曲线都没有再一定范围内起峰的话，溶解曲线即使是单一峰又有什么用呢？况且你还要看峰的尖锐程度，峰的高低。我就说这么几个例子吧： 1. 以前用某乐的96-microplate，总在77~80度左右有单一小侧峰，考虑引物问题等众多事情后仍旧无解，最后同样实验条件使用某A的8-Strip tube，前边的杂峰消除。 2. 做过NTC，发现三重复都在38Ct时左右起峰，溶解曲线很单一，与内参同温度，但峰最高值是其一半左右，至今仍无解。 所以你只能有扩增才能用溶解来证明是不是扩增正确，而不能没扩增却用溶解来说明有扩增，如果实在不放心，那就那扩增产物跑胶，理论可行，但我没有试过。 那个阙值线的问题，你可以参照偶回答的帖子 http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=4305783&authorid=1099992 祝实验顺利  如有说错，请高手指点 |
4楼2012-03-28 09:47:03
atlanticwi
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+4, 很热心很耐心！个人也认为是无扩增…… 2012-03-28 11:10:23
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+4, 很热心很耐心！个人也认为是无扩增…… 2012-03-28 11:10:23
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嗯........................ 我是这样认为的： 你看到那个红色的线了吗，那应该是阙值线，如果你没有手动调整过的话，在阙值线以下的都是背景杂信号，忽上忽下的很正常，后边没有在一定范围内起峰，说明是无产物扩增的，如果你用的SYBR Green I 法，也同时会有溶解曲线分析吧，若那里边也是没有很尖锐的峰出现（我这里是笼统的说法），只能说明你这个扩增是没有产物出现的。而且你图不是很清晰，看不清楚纵轴是什么标示。 问题很多，不能在这一概而就的说明 希望有所帮助，如果有说错地方，请各位高手指点 |
2楼2012-03-27 20:27:47
3楼2012-03-28 09:05:33
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