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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 荧光定量PCR的扩增曲线很奇怪，什么原因
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杜越欧

新虫 (初入文坛)

[求助] 荧光定量PCR的扩增曲线很奇怪，什么原因 已有2人参与

第一次做荧光定量PCR，得到的扩增曲线很奇怪，不知道是什么原因，求指教！还有要是CT值过高是不是应该增加模板的浓度啊？
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1楼 2012-03-27 19:58:22
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+4, 很热心很耐心！个人也认为是无扩增…… 2012-03-28 11:10:23
嗯........................
我是这样认为的：
你看到那个红色的线了吗，那应该是阙值线，如果你没有手动调整过的话，在阙值线以下的都是背景杂信号，忽上忽下的很正常，后边没有在一定范围内起峰，说明是无产物扩增的，如果你用的SYBR Green I 法，也同时会有溶解曲线分析吧，若那里边也是没有很尖锐的峰出现（我这里是笼统的说法），只能说明你这个扩增是没有产物出现的。而且你图不是很清晰，看不清楚纵轴是什么标示。
问题很多，不能在这一概而就的说明
希望有所帮助，如果有说错地方，请各位高手指点
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Let God do with it as He wills
2楼2012-03-27 20:27:47
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杜越欧

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-03-27 20:27:47:
嗯........................
我是这样认为的：
你看到那个红色的线了吗，那应该是阙值线，如果你没有手动调整过的话，在阙值线以下的都是背景杂信号，忽上忽下的很正常，后边没有在一定范围内起峰，说明是无产物 ...

非常感谢，但是我的溶解曲线有单一峰，而且特异性非常好啊。那就说明有扩增产物啊。那个阈值通常需要改动么？
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3楼2012-03-28 09:05:33
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 最近很犀利啊~Real-time产物跑胶是可行的，我自己也做过，嘿嘿~ 2012-03-28 11:12:13
引用回帖:
3楼: Originally posted by 杜越欧 at 2012-03-28 09:05:33:
非常感谢，但是我的溶解曲线有单一峰，而且特异性非常好啊。那就说明有扩增产物啊。那个阈值通常需要改动么？

嗯.....
个人看法：
为什么大家把溶解曲线看的这么重要呢，我觉得本末倒置了，若是你的扩增曲线都没有再一定范围内起峰的话，溶解曲线即使是单一峰又有什么用呢？况且你还要看峰的尖锐程度，峰的高低。我就说这么几个例子吧：
1. 以前用某乐的96-microplate，总在77~80度左右有单一小侧峰，考虑引物问题等众多事情后仍旧无解，最后同样实验条件使用某A的8-Strip tube，前边的杂峰消除。
2. 做过NTC，发现三重复都在38Ct时左右起峰，溶解曲线很单一，与内参同温度，但峰最高值是其一半左右，至今仍无解。
所以你只能有扩增才能用溶解来证明是不是扩增正确，而不能没扩增却用溶解来说明有扩增，如果实在不放心，那就那扩增产物跑胶，理论可行，但我没有试过。
那个阙值线的问题，你可以参照偶回答的帖子
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=4305783&authorid=1099992
祝实验顺利
如有说错，请高手指点
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Let God do with it as He wills
4楼2012-03-28 09:47:03
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杜越欧

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-03-28 09:47:03:
嗯.....
个人看法：
为什么大家把溶解曲线看的这么重要呢，我觉得本末倒置了，若是你的扩增曲线都没有再一定范围内起峰的话，溶解曲线即使是单一峰又有什么用呢？况且你还要看峰的尖锐程度，峰的高低。我就说这 ...

非常感谢，我再做一次看看效果吧
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5楼2012-03-28 10:24:39
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doglet

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

稀释100倍模板再试试，一般是模板量太大了
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6楼2013-11-13 14:55:56
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wskiddy

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

模板浓度降低后怎么样？楼主解决这个问题了吗？
我最近也遇到类似的扩增曲线，但我的几个样品中，每次只有一个样品发生这种奇怪的扩增曲线。其他样品的多个基因扩增都很正常。推测是模板中混有影响荧光测定的东西。不知乙醇，异丙醇残余是否有影响。
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7楼2014-07-10 22:22:38
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gengkan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

个人感觉是没有有效扩增，没有看到指数期和平台期，楼主再稀释一下模版看看吧。
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8楼2015-04-24 10:29:54
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