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消锦lzhy

新虫 (初入文坛)


[求助] 定量pcr标曲

请教各位虫友:我之前做定量pcr(sybr green法)标准曲线,由于引物二聚体比较严重,10的5次方拷贝数以下就不准确了,现在考虑换一对新的引物,但是试着做了一下,也有个很严重的问题,就是所有的标准品Ct值几乎一样,我是做了梯度稀释,从10的2次方到10的八次方,不过没有非特异性产物,不知什么原因。我在想是不是需要重新做标准品呢?因为原来的标准品是用原来那个400bp左右的引物的pcr产物做克隆再提取质粒得到的,现在想换一对200bp左右的引物,需要重新做标准品吗吗?(注:我用新的引物试着扩增了一下原标准品,也有比较清晰的条带)
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消锦lzhy

新虫 (初入文坛)


引用回帖:
6楼: Originally posted by cheng_xiao at 2012-04-22 15:30:13:
这样的话,是不是你的引物特异性不高啊,或者你试验中老有污染啊,建议你做一个隐性对照看一下

恩,好的,谢谢
7楼2012-04-22 16:35:59
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查看全部 7 个回答

孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-04-22 14:15:59
首先考虑是你的稀释方式原因吧。可能方式不对。其次做下NTC,如果无酶水被污染了,每个样品的Ct值是一样,同时稀释倍数越高Ct值稍稍增加。最后,再考虑下是你的标准品的问题吧。祝楼主实验顺利
2楼2012-04-22 09:50:34
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cheng_xiao

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 确实 2012-04-22 19:16:05
你还是用新的引物吧,扩增400多bp太大,一般就100bp多,引物是实验好坏一大关键因素, 我觉得是这样,实验顺利啊
我努力我奋斗我成功
3楼2012-04-22 10:25:16
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消锦lzhy

新虫 (初入文坛)


引用回帖:
2楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-04-22 09:50:34:
首先考虑是你的稀释方式原因吧。可能方式不对。其次做下NTC,如果无酶水被污染了,每个样品的Ct值是一样,同时稀释倍数越高Ct值稍稍增加。最后,再考虑下是你的标准品的问题吧。祝楼主实验顺利

灰常感谢~不过我想污染的问题和稀释的问题不存在,因为用同样的标准品和试剂,用400bp的引物做的时候不存在污染,而且Ct值也有差异,就是不太明白如果要换引物标准品是不是也要相应的换?
4楼2012-04-22 14:47:22
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