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求知似渴

铁虫 (初入文坛)

[求助] 相对定量PCR 基线

仪器是ABI 7500，用SYBR Green ，样品较多，1个基因和1个内参


我想问：1，每个板子上都要加 “校正器样本”么？能不能分成不同板子？

        2，分析数据的时候，基线用自动的好，还是手调？

           手调的话，是不是所有的板子基线对应的值大小必须一样啊？

           自动的话，发现有的板子上的数据很差，怎么办？

小弟第一次做，谢谢！

八楼有分享资料

[ Last edited by 1949stone on 2011-5-5 at 10:52 ]
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1楼 2011-05-04 15:45:30
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2, EPI+1): 鼓励发帖应助。 2011-05-04 20:17:19
基线的选择有一定的计算公式的，用机器自动设置就好。基线的设置一般不会影响最终的结果（前提是设置正确哦），数据差的话，从其他方面找原因吧。你说的“数据差”指哪一方面？
不是所有的板子的基线都要一样--因为不影响结果。
“校正器样本”我没用过呢，孤陋寡闻了，这个帮不了你哦。可否请教下？呵呵~
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2楼2011-05-04 16:38:29
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求知似渴

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-05-04 16:38:29:
基线的选择有一定的计算公式的，用机器自动设置就好。基线的设置一般不会影响最终的结果（前提是设置正确哦），数据差的话，从其他方面找原因吧。你说的“数据差”指哪一方面？
不是所有的板子的基线都要一样--因 ...

数据差：基线弄成自动的话，有很多数据没有CT值！
校正器样本：我看说明书上，好像就是指对照组！

基线不一样的话，CT值也有变化，怎么说没影响啊？
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3楼2011-05-04 20:08:10
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
求知似渴(金币+2): 谢谢，还有请教 2011-05-05 09:51:07
dhd997(金币+3): good 2011-05-05 10:33:50
求知似渴(金币+1): 2011-05-06 14:09:47
引用回帖:
Originally posted by 求知似渴 at 2011-05-04 20:08:10:
数据差：基线弄成自动的话，有很多数据没有CT值！
校正器样本：我看说明书上，好像就是指对照组！

基线不一样的话，CT值也有变化，怎么说没影响啊？

你说的基线是阈值线吧？阈值线设置会造成Ct值的变化，但Ct值的差（△Ct值）是不变的（设置正确的话），对定量结果影响不大。
如果连自动的都没有Ct值，那就是你实验本身有问题了。这个不好说，得看具体情况，你最好把扩增曲线的图传上来，让大家看看吧。
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4楼2011-05-04 20:54:10
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求知似渴

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-05-04 20:54:10:
你说的基线是阈值线吧？阈值线设置会造成Ct值的变化，但Ct值的差（△Ct值）是不变的（设置正确的话），对定量结果影响不大。
如果连自动的都没有Ct值，那就是你实验本身有问题了。这个不好说，得看具体情况， ...

图片上传老失败，不好意思！

“Ct值的差（△Ct值）是不变的（设置正确的话），对定量结果影响不大。”

这就行了，谢谢诶！

用2-△△Ct算法的话，对照组是不是必须每个板子上都得加，

我开始做的时候，忘了，所以对照组，实验组在不同板子上， 结果影响大不？谢谢！
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5楼2011-05-05 09:50:38
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zhjzhou

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+6): good 2011-05-05 10:34:02
求知似渴(金币+1): 2011-05-06 14:10:03
我认为实验组和对照组在不同板上，要调成一样的SYBR数值，这样才背景一样啊，我这样实验过，在不同板上调成一样和在同一板上做，结果一样的，不调一样的话，结果不一样的
在这里问各位个问题，你们定量上样的模板浓度有没有调成一致？还有跑出的内参照的Ct值是否都一样，就是对照组和处理组的内参基因的Ct是否要相差不大，如果相差太大是否有问题？
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6楼2011-05-05 10:08:39
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求知似渴

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by zhjzhou at 2011-05-05 10:08:39:
我认为实验组和对照组在不同板上，要调成一样的SYBR数值，这样才背景一样啊，我这样实验过，在不同板上调成一样和在同一板上做，结果一样的，不调一样的话，结果不一样的
在这里问各位个问题，你们定量上样的模板 ...

“要调成一样的SYBR数值”是指浓度吧？！

1  我试验中模板浓度调一样了，但是好像没必要，因为 有内参基因，就是为了消除模板浓度的误差，

2  不同样品的内参值肯定不同的，用2-△△Ct算法就是把误差去掉的
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7楼2011-05-05 10:39:54
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求知似渴

铁虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★
1949stone(金币+5): 提问 加 分享资料 鼓励 2011-05-05 10:43:58
我上传2分说明书，里边有讲用2-△△Ct算法，但是不太明白：“加样的中，每

个板子上是否都有对照组？”
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8楼2011-05-05 10:42:39
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zhjzhou

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
1949stone(金币+5): 鼓励 2011-05-05 10:50:39
引用回帖:
Originally posted by 求知似渴 at 2011-05-05 10:39:54:
“要调成一样的SYBR数值”是指浓度吧？！

1  我试验中模板浓度调一样了，但是好像没必要，因为 有内参基因，就是为了消除模板浓度的误差，

2  不同样品的内参值肯定不同的，用2-△△Ct算法就是把误差去掉的

“要调成一样的SYBR数值”是指浓度吧？！

这个不是浓度是你仪器上扩增平台出现Ct值的那个SYBR的临界值，许多仪器上是可以调整的


2  不同样品的内参值肯定不同的，用2-△△Ct算法就是把误差去掉的

那处理组和对照组的内参基因跑出的Ct值也相差很大没有问题吗？要是这样不是模板有问题吗？
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9楼2011-05-05 10:44:11
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475502411

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 很牛哦 2011-05-05 12:40:58
求知似渴(金币+1): 2011-05-07 10:51:12
如果你要发表文章需要图片，而感觉图片不够漂亮可以调一下，一般不用调的。用默认值就行了因为每板的扩增效率不同，样品浓度不同，阈值当然不一样，CT值自然也不同
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
10楼2011-05-05 10:54:28
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