应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 菌液PCR验证又失败了
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
161/2返回列表12下一页
查看: 3684  |  回复: 15
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看

madengyu

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

【分子生物】EPI帖

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2011-08-29 19:20:04
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

xbl3688

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
dhd997(金币+2): 楼主奖励 2011-08-30 07:58:50
dhd997(金币+2): good 2011-08-30 07:58:58
1、你都没有设置阳性对照吗？ 菌液PCR的时候这个很重要，如果阳性正常可以排除PCR体系和程序的问题。
2、你的问题的话，模板量是不是有点少，我是用200ul菌液离心，煮沸10分钟，加25ul灭菌水作为模板，25ul的体系加20ul。
3、另外一个这个退火温度是不是高了，一般是引物Tm值减去5左右。之前这个温度做出来过吗？不确定退火温度的话，不妨做个60-50℃的降落PCR。
赞一下(4人) 回复此楼
生活的乐趣在于善于发现美，学会欣赏美
5楼2011-08-29 21:45:04
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
madengyu(金币+2): 2011-08-30 07:53:51
dhd997(金币+5, MolEPI+1): 2011-08-30 07:57:45
首先我想知道的是楼主所要扩增的片段是多大，不过通过你的PCR程序延伸时间可以看出来应该稍微大一点；
没有P出来很正常，关键是要找原因
问题：
1：PCR体系不尽合理，20ul体系中模板和dNTP添加量过多，一般情况下50ul：
taq:1ul
dNTP:1ul
模板:1ul
引物:各1ul
buffer:5ul
可以先变体系做做看看；
2：另外有可能是你的PCR程序不是很合理。。。
3：也有可能你做克隆压根没有连接上，所以PCR肯定没有结果，不过没有做出来PCR不代表没有连接上，可以提取质粒酶切看看结果怎样？

祝你好运！
赞一下(4人) 回复此楼
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
6楼2011-08-29 22:28:52
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
直接将内容贴出来以便应助。。。
赞一下(1人) 回复此楼
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
2楼2011-08-29 19:47:49
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

amisking

荣誉版主 (文坛精英)

优秀区长优秀版主
引用回帖:
2楼: Originally posted by 天使托 at 2011-08-29 19:47:49:
直接将内容贴出来以便应助。。。

我帮他编辑了
回复此楼
如果没有人帮助你，那么你就去帮助别人。
3楼2011-08-29 20:29:27
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liling77ll

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 楼主奖励 2011-08-30 07:58:40
跑菌液不需变性那么久的吧？还有保证菌液活的，感觉你菌液没加进去或者没活性，个人观点，呵呵
赞一下(2人) 回复此楼
做最好的自己，和自己的昨天对比
4楼2011-08-29 21:16:47
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

补充一下：
还有就是你要添加一个阳性对照，这样才合理一些。。。
赞一下(1人) 回复此楼
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
7楼2011-08-29 22:30:12
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xiaoyue83

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): Good 2011-08-30 18:39:01
我之前遇到过这种情况，菌液稀释后，沸水煮5min,质粒比较容易释放，希望对你有帮助。
赞一下(3人) 回复此楼
8楼2011-08-29 23:07:29
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zgb1982

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励交流！P不出来是应该降低退火温度了。我们一般是55℃。 2011-08-30 18:40:41
变性时间太久了，5分钟足够了。我们都是直接菌落PCR，就按正常的程序走，都能扩出来的。还有退火你确定要那么高吗。不知道你引物是载体片段还是连接片段上的。
赞一下(2人) 回复此楼
9楼2011-08-30 09:35:26
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sxxuan

金虫 (著名写手)
★ ★ ★
西瓜(金币+3): good 2011-08-30 18:40:59
体系中buffer加多了吧，dNTP也是。引物加多少看浓度是不是？我一般是10p的浓度，50ul体系就各加1ul
菌液鉴定很容易有假阳性，所以应该要设阳性和阴性对照，这样就比较容易把问题锁定在几个范围内。如果PCR产物没问题的话，可能连接出问题了，连接酶或T载体都是比较容易失活的
赞一下(2人) 回复此楼
你的日子如何，你的力量也必如何！
10楼2011-08-30 14:20:27
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 madengyu 的主题更新
161/2返回列表12下一页
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 081700学硕，323分，一志愿中国海洋大学求调剂学校 +16 披星河 2026-04-04 16/800 2026-04-05 11:27 by 猪会飞
[考研] 0703总分331求调剂 +10 ZY-05 2026-04-04 13/650 2026-04-05 11:03 by xiayan13521
[考研] 358求调剂 +6 秋gk 2026-04-04 6/300 2026-04-05 11:01 by xiayan13521
[考研] 求调剂 +10 熊二想上岸 2026-04-04 10/500 2026-04-05 08:09 by qlm5820
[考研] 313求调剂 +3 海日海日 2026-04-04 3/150 2026-04-05 07:48 by 544594351
[考研] 求调剂 +7 xzghyuj 2026-04-04 7/350 2026-04-04 22:25 by oooqiao
[考研] 341求调剂 +3 洛多罗 2026-04-02 4/200 2026-04-04 21:36 by 智能智慧
[考研] 。 +5 雾与海 2026-04-02 6/300 2026-04-04 19:53 by 蓝云思雨
[考研] 321求调剂 +6 认真求上学 2026-04-03 6/300 2026-04-04 19:51 by dongzh2009
[考研] [调剂信息]085408光电信息 求调剂 总分291分数一英一 +3 iz11az 2026-04-02 3/150 2026-04-04 19:09 by 蓝云思雨
[考研] 368求调剂 +5 今华习 2026-04-03 7/350 2026-04-04 18:47 by imissbao
[考研] 材料专硕322分 +7 哈哈哈吼吼吼哈 2026-04-04 7/350 2026-04-04 12:09 by asdhh1991
[考研] 一志愿上海海洋大学083200食品学硕，求调剂，接受其他专业083200 +3 what张 2026-04-04 4/200 2026-04-04 09:50 by rzh123456
[考研] 材料295 +13 小英11 2026-04-03 14/700 2026-04-04 09:02 by 来看流星雨10
[考研] 338求调剂，一志愿能源动力，外语是日语203 +5 zzz，，r 2026-04-02 5/250 2026-04-03 09:45 by 蓝云思雨
[考研] 322求调剂 +5 熹僖XX 2026-03-31 6/300 2026-04-02 10:08 by 求调剂zz
[考研] 0817化工学硕调剂 +11 努力上岸中！ 2026-03-31 11/550 2026-04-01 20:30 by 赖春艳
[考研] 303分 0807学硕求调剂 +3 TYC3632 2026-04-01 3/150 2026-04-01 19:24 by lwk2004
[考研] 一志愿浙江大学工科动力工程370,数一121,专业课135，现在能去哪里 +3 080700调剂 2026-03-30 4/200 2026-03-31 12:00 by KLMY666
[考研] 323分 食品与营养调剂 +3 嘿ooo 2026-03-31 3/150 2026-03-31 09:38 by longlotian
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭