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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 菌液PCR验证又失败了
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madengyu

禁虫 (小有名气)
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【分子生物】EPI帖

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1楼 2011-08-29 19:20:04
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

xbl3688

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
dhd997(金币+2): 楼主奖励 2011-08-30 07:58:50
dhd997(金币+2): good 2011-08-30 07:58:58
1、你都没有设置阳性对照吗？ 菌液PCR的时候这个很重要，如果阳性正常可以排除PCR体系和程序的问题。
2、你的问题的话，模板量是不是有点少，我是用200ul菌液离心，煮沸10分钟，加25ul灭菌水作为模板，25ul的体系加20ul。
3、另外一个这个退火温度是不是高了，一般是引物Tm值减去5左右。之前这个温度做出来过吗？不确定退火温度的话，不妨做个60-50℃的降落PCR。
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生活的乐趣在于善于发现美，学会欣赏美
5楼2011-08-29 21:45:04
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
madengyu(金币+2): 2011-08-30 07:53:51
dhd997(金币+5, MolEPI+1): 2011-08-30 07:57:45
首先我想知道的是楼主所要扩增的片段是多大，不过通过你的PCR程序延伸时间可以看出来应该稍微大一点；
没有P出来很正常，关键是要找原因
问题：
1：PCR体系不尽合理，20ul体系中模板和dNTP添加量过多，一般情况下50ul：
taq:1ul
dNTP:1ul
模板:1ul
引物:各1ul
buffer:5ul
可以先变体系做做看看；
2：另外有可能是你的PCR程序不是很合理。。。
3：也有可能你做克隆压根没有连接上，所以PCR肯定没有结果，不过没有做出来PCR不代表没有连接上，可以提取质粒酶切看看结果怎样？

祝你好运！
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6楼2011-08-29 22:28:52
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普通回帖

天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
直接将内容贴出来以便应助。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
2楼2011-08-29 19:47:49
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amisking

荣誉版主 (文坛精英)

优秀区长优秀版主
引用回帖:
2楼: Originally posted by 天使托 at 2011-08-29 19:47:49:
直接将内容贴出来以便应助。。。

我帮他编辑了
回复此楼
如果没有人帮助你，那么你就去帮助别人。
3楼2011-08-29 20:29:27
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liling77ll

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 楼主奖励 2011-08-30 07:58:40
跑菌液不需变性那么久的吧？还有保证菌液活的，感觉你菌液没加进去或者没活性，个人观点，呵呵
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做最好的自己，和自己的昨天对比
4楼2011-08-29 21:16:47
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

补充一下：
还有就是你要添加一个阳性对照，这样才合理一些。。。
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7楼2011-08-29 22:30:12
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xiaoyue83

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): Good 2011-08-30 18:39:01
我之前遇到过这种情况，菌液稀释后，沸水煮5min,质粒比较容易释放，希望对你有帮助。
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8楼2011-08-29 23:07:29
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zgb1982

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励交流！P不出来是应该降低退火温度了。我们一般是55℃。 2011-08-30 18:40:41
变性时间太久了，5分钟足够了。我们都是直接菌落PCR，就按正常的程序走，都能扩出来的。还有退火你确定要那么高吗。不知道你引物是载体片段还是连接片段上的。
赞一下(2人) 回复此楼
9楼2011-08-30 09:35:26
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sxxuan

金虫 (著名写手)
★ ★ ★
西瓜(金币+3): good 2011-08-30 18:40:59
体系中buffer加多了吧，dNTP也是。引物加多少看浓度是不是？我一般是10p的浓度，50ul体系就各加1ul
菌液鉴定很容易有假阳性，所以应该要设阳性和阴性对照，这样就比较容易把问题锁定在几个范围内。如果PCR产物没问题的话，可能连接出问题了，连接酶或T载体都是比较容易失活的
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你的日子如何，你的力量也必如何！
10楼2011-08-30 14:20:27
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