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madengyu

禁虫 (小有名气)

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xbl3688

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
dhd997(金币+2): 楼主奖励 2011-08-30 07:58:50
dhd997(金币+2): good 2011-08-30 07:58:58
1、你都没有设置阳性对照吗? 菌液PCR的时候这个很重要,如果阳性正常可以排除PCR体系和程序的问题。
2、你的问题的话,模板量是不是有点少,我是用200ul菌液离心,煮沸10分钟,加25ul灭菌水作为模板,25ul的体系加20ul。
3、另外一个这个退火温度是不是高了,一般是引物Tm值减去5左右。之前这个温度做出来过吗?不确定退火温度的话,不妨做个60-50℃的降落PCR。
生活的乐趣在于善于发现美,学会欣赏美
5楼2011-08-29 21:45:04
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
madengyu(金币+2): 2011-08-30 07:53:51
dhd997(金币+5, MolEPI+1): 2011-08-30 07:57:45
首先我想知道的是楼主所要扩增的片段是多大,不过通过你的PCR程序延伸时间可以看出来应该稍微大一点;
没有P出来很正常,关键是要找原因
问题:
1:PCR体系不尽合理,20ul体系中模板和dNTP添加量过多,一般情况下50ul:
taq:1ul
dNTP:1ul
模板:1ul
引物:各1ul
buffer:5ul
可以先变体系做做看看;
2:另外有可能是你的PCR程序不是很合理。。。
3:也有可能你做克隆压根没有连接上,所以PCR肯定没有结果,不过没有做出来PCR不代表没有连接上,可以提取质粒酶切看看结果怎样?

祝你好运!
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
6楼2011-08-29 22:28:52
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普通回帖

天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

直接将内容贴出来以便应助。。。
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
2楼2011-08-29 19:47:49
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amisking

荣誉版主 (文坛精英)

优秀区长优秀版主

引用回帖:
2楼: Originally posted by 天使托 at 2011-08-29 19:47:49:
直接将内容贴出来以便应助。。。

我帮他编辑了
如果没有人帮助你,那么你就去帮助别人。
3楼2011-08-29 20:29:27
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liling77ll

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 楼主奖励 2011-08-30 07:58:40
跑菌液不需变性那么久的吧?还有保证菌液活的,感觉你菌液没加进去或者没活性,个人观点,呵呵
做最好的自己,和自己的昨天对比
4楼2011-08-29 21:16:47
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

补充一下:
还有就是你要添加一个阳性对照,这样才合理一些。。。
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
7楼2011-08-29 22:30:12
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xiaoyue83

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): Good 2011-08-30 18:39:01
我之前遇到过这种情况,菌液稀释后,沸水煮5min,质粒比较容易释放,希望对你有帮助。
8楼2011-08-29 23:07:29
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zgb1982

木虫 (正式写手)

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励交流!P不出来是应该降低退火温度了。我们一般是55℃。 2011-08-30 18:40:41
变性时间太久了,5分钟足够了。我们都是直接菌落PCR,就按正常的程序走,都能扩出来的。还有退火你确定要那么高吗。不知道你引物是载体片段还是连接片段上的。
9楼2011-08-30 09:35:26
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sxxuan

金虫 (著名写手)

★ ★ ★
西瓜(金币+3): good 2011-08-30 18:40:59
体系中buffer加多了吧,dNTP也是。引物加多少看浓度是不是?我一般是10p的浓度,50ul体系就各加1ul
菌液鉴定很容易有假阳性,所以应该要设阳性和阴性对照,这样就比较容易把问题锁定在几个范围内。如果PCR产物没问题的话,可能连接出问题了,连接酶或T载体都是比较容易失活的
你的日子如何,你的力量也必如何!
10楼2011-08-30 14:20:27
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