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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于提高转化整合率
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雨后郁金香

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于提高转化整合率已有4人参与

本人做一个微生物的转化，目前只能确定的是质粒转进去了，但是它没有整合到基因组上，想问问，有没有人做过这方面的，怎样可以提高或者说是让质粒整合到基因组DNA上……
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1楼2010-09-01 18:57:09
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liouwzh

木虫 (正式写手)
★
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我怀疑楼主可能没有将质粒导入菌体。因为通过抗生素标记的筛选由于菌株的突变获得抗性而造成假阳性。而且一般来说整合型穿梭质粒大部分都是自杀质粒，导入目的宿主菌时不能在染色体外复制，而只能整合到染色体。建议楼主做个菌落PCR，这样就可验证整个细胞中是否存在质粒。
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9楼2010-09-02 10:37:16
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★ ★ ★
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amisking(金币+2):鼓励交流！ 2010-09-01 20:03:03
"质粒转进去了，但是它没有整合到基因组上"
你这个质粒是整合型的吧，难道可以自己复制？
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Thank-you，so-blue.
2楼2010-09-01 19:02:18
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雨后郁金香

金虫 (小有名气)
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Originally posted by susizheng at 2010-09-01 19:02:18:
"质粒转进去了，但是它没有整合到基因组上"
你这个质粒是整合型的吧，难道可以自己复制？

老外的一个质粒，还真是不清楚呀。就是验证的时候发现它根本没有整合进基因组上……
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3楼2010-09-01 20:04:46
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雨后郁金香

金虫 (小有名气)
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Originally posted by susizheng at 2010-09-01 19:02:18:
"质粒转进去了，但是它没有整合到基因组上"
你这个质粒是整合型的吧，难道可以自己复制？

整合型跟复制型怎么区分呀？
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4楼2010-09-01 20:08:29
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
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Originally posted by 雨后郁金香 at 2010-09-01 20:04:46:

老外的一个质粒，还真是不清楚呀。就是验证的时候发现它根本没有整合进基因组上……

一般整合型质粒是不能独立复制的，不知道你转质粒后，是用的什么筛选筛阳性克隆。
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Thank-you，so-blue.
5楼2010-09-01 20:08:49
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雨后郁金香

金虫 (小有名气)
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Originally posted by susizheng at 2010-09-01 20:08:49:

一般整合型质粒是不能独立复制的，不知道你转质粒后，是用的什么筛选筛阳性克隆。

先是抗性初筛，然后提基因组DNA做PCR验证。
现在就是发现，菌在抗性培养液中可以增长，但是提基因组验证不到，怀疑是游离在菌体内的……
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6楼2010-09-01 21:55:43
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雨后郁金香

金虫 (小有名气)
补充楼上的，刚查了下，这个质粒是个大肠跟酵母的穿梭质粒，这样的话应当只是个复制型的质粒，而不是整合型质粒吧
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7楼2010-09-01 22:05:30
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
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Originally posted by 雨后郁金香 at 2010-09-01 22:05:30:
补充楼上的，刚查了下，这个质粒是个大肠跟酵母的穿梭质粒，这样的话应当只是个复制型的质粒，而不是整合型质粒吧

是不是复制型看看质粒有没有在酵母中的复制位点就可以了。一般是2μ或者CEN。如果是整合型的，就会有整合位点，转化前最好线性化。
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Thank-you，so-blue.
8楼2010-09-02 09:10:29
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雨后郁金香

金虫 (小有名气)
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Originally posted by liouwzh at 2010-09-02 10:37:16:
我怀疑楼主可能没有将质粒导入菌体。因为通过抗生素标记的筛选由于菌株的突变获得抗性而造成假阳性。而且一般来说整合型穿梭质粒大部分都是自杀质粒，导入目的宿主菌时不能在染色体外复制，而只能整合到染色体。建 ...

哦，这样啊，我以前还会做菌落PCR，后来觉得菌落PCR存在假阳性，所以都直接提DNA做PCR.可是昨天提的DNA跑出来是三条带，感觉像是质粒，然后PCR也有抗性基因存在，所以就怀疑基因没有整合到染色体上……
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10楼2010-09-02 12:08:35
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