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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酵母转化假阳性
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皇马铁卫

铜虫 (正式写手)

[交流] 酵母转化假阳性

最近在做毕赤酵母电转。转的是PCR片段，1.7kb，带G418抗性基因。做了很多次，药物板上长了很多，转涂在新的药物板上仍然可以长，但是提基因组做PCR就是没有。阴性对照的板子上没长。
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1楼 2012-08-30 10:58:39
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
皇马铁卫: 金币+1 2012-08-30 16:47:08
会不会是你的G418失效了呀?你添加的浓度是多大呢？
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2楼2012-08-30 11:11:49
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皇马铁卫

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by piaoyunokok at 2012-08-30 11:11:49
会不会是你的G418失效了呀?你添加的浓度是多大呢？

我已经加到300μg/ml。阴性的是没有长啊
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3楼2012-08-30 11:37:37
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gwd0312

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
皇马铁卫: 金币+2, 这个有可能 2012-08-31 09:12:44
可能是你提取方法有问题，或者你提取的基因组DNA 浓度过大导致P不出来，最后一种可能就是你的PCR程序有问题！
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4楼2012-08-30 11:47:30
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啊Q精神

木虫 (小有名气)
★
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amisking: 回帖置顶 2012-08-30 20:11:03
未转化的毕赤酵母在那么大浓度的G418板上长不长？
菌落PCR吗？
可以用煮冻煮的方法处理酵母菌，然后用上清做PCR
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5楼2012-08-30 14:00:20
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
皇马铁卫: 金币+1 2012-08-31 09:12:56
引用回帖:
3楼: Originally posted by 皇马铁卫 at 2012-08-30 11:37:37
我已经加到300μg/ml。阴性的是没有长啊...

那有可能你的基因组提的效果不是很好，或者PCR不好的。整个过程的影响因素好多的。
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6楼2012-08-30 16:05:00
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皇马铁卫

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by gwd0312 at 2012-08-30 11:47:30
可能是你提取方法有问题，或者你提取的基因组DNA 浓度过大导致P不出来，最后一种可能就是你的PCR程序有问题！

不是啊，用其他引物可以P出来
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7楼2012-08-30 16:48:02
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gwd0312

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
皇马铁卫: 金币+1, 之前已经摸好条件了 2012-08-31 09:13:21
引用回帖:
7楼: Originally posted by 皇马铁卫 at 2012-08-30 16:48:02
不是啊，用其他引物可以P出来...

P的时候做个温度梯度试一下吧！
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8楼2012-08-30 17:33:24
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皇马铁卫

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by gwd0312 at 2012-08-30 17:33:24
P的时候做个温度梯度试一下吧！...

阳性对照是有条带的 啊
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9楼2012-08-30 18:18:50
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chongju135

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
用通用引物p，阴性的话也能p出，阳性的p出的条带应该比阴性的大。如果都p不出的话，可能是你提dna的问题，尝试一下用溶壁酶。
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10楼2012-08-31 08:36:56
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Nabarro

新虫 (小有名气)
Kit才是王道
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11楼2012-08-31 10:25:28
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wujunchina2002

木虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验 2012-08-31 15:58:34
皇马铁卫: 金币+3 2012-08-31 18:04:36
皇马铁卫: 回帖置顶 2012-08-31 18:04:37
我以前做酵母转化也遇到过和你一模一样的情况。用G418做就是这个样子。那时差不多200个克隆中才有一个是阳性的，其他全是假阳性。后来换用zeocin抗生素就好了，没有假阳性问题。我也试图寻找过用G418时消除假阳性的办法，比如提高抗生素浓度等，但是根本没有用。
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12楼2012-08-31 11:24:15
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