应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 目的片段和pMD18-T simple vector 的连接
211/3返回列表123下一页
查看: 3026  |  回复: 20
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

lvye3707

金虫 (正式写手)

[求助] 目的片段和pMD18-T simple vector 的连接 已有1人参与

我做了四次了，目的片段保存在菌液里，用含有酶切位点的正向引物和反向引物扩增条带很亮，胶回收很亮，用TAKARA试剂盒连接16℃ 14--16h，转化自制的大肠杆菌DH5α，涂在氨苄抗性的板上，板上能长10+个斑，挑其中的6个，全是假阳性的，求大侠了
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

实验操作

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-11-28 20:56:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖置顶 ( 共有2个 )

王文钊-

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lvye3707: 金币+5, 谢谢啊，我换个感受态试试 2012-12-02 20:47:10
lvye3707: 回帖置顶 2012-12-03 09:33:53
感觉可能是感受态有问题了，我们有时候用自己做的感受态也有问题，后来买了试剂公司的感受态，就做出来了。用过TAKARA的DH5a,还有全式金的trans-T1
赞一下 回复此楼
14楼2012-11-30 20:39:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ym6104

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lvye3707: 金币+5, ★有帮助, 可我的菌长啊，这可能是的？感受态怎么影响 2012-12-02 20:48:35
lvye3707: 回帖置顶 2012-12-03 09:33:57
之前也出现过楼主的这种情况，后来换成全式金的T1，就没出现过了。。。如果找不到其他原因的话，可以考虑换个感受态试试。。。
赞一下 回复此楼
15楼2012-11-30 23:00:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lvye3707: 金币+5, ★有帮助, 谢谢 2012-11-29 20:48:28
还有就是你的连接是连了十多个小时，我记得T载体连接时间挺短的啊，一般是在一个小时以内，你最好看看说明书吧~
比例的问题的话，其实应该少加载体多加片段才对~
赞一下(1人) 回复此楼
8楼2012-11-29 19:56:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wangqi20092

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lvye3707: 金币+5, ★有帮助, 春哥有用的话，我都想拜他八辈祖宗了 2012-12-02 21:46:12
第一，确定你用的PCR酶是不是在末尾加A了？第二，确定你的连接体系按说明书做的，混匀再16度连接；第三，保证你的氨苄浓度是100mg/mL，是LB培养基；第四，保证你的感受态能用；第五，转化过程确定你用的是冰浴30min，42度90s，冰2min，然后加800ul LB，不含抗生素，170rpm摇1h涂板。如果以上问题都正确，再不出来，那就拜拜春哥吧！！！
赞一下(1人) 回复此楼
10楼2012-11-30 10:50:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

bloodwar

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lvye3707: 金币+5, ★有帮助 2012-11-29 08:37:21
你是做T-A连接的吗，含有酶切位点最好是双酶切后再连啊，用Promega的pGET载体试试吧
赞一下 回复此楼
2楼2012-11-29 05:18:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lvye3707: 金币+5, ★有帮助 2012-11-29 15:00:22
连接转化后，涂板前培养菌液后，请用通用引物和你自己的特异引物同时做菌落PCR来检测，确定连接是成功的而不是载体自连。
赞一下 回复此楼
3楼2012-11-29 08:46:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lvye3707

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by chenguestc at 2012-11-29 08:46:43
连接转化后，涂板前培养菌液后，请用通用引物和你自己的特异引物同时做菌落PCR来检测，确定连接是成功的而不是载体自连。

转化培养菌液后，我用含酶切位点的引物菌液PCR，跑出来的都是空条带，说明是载体自连么？
赞一下 回复此楼
4楼2012-11-29 15:00:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
lvye3707: 金币+5, ★有帮助, 也换过其他的试剂盒，TA克隆对PCR产物末端有要求么？ 2012-11-29 15:32:31
引用回帖:
4楼: Originally posted by lvye3707 at 2012-11-29 15:00:09
转化培养菌液后，我用含酶切位点的引物菌液PCR，跑出来的都是空条带，说明是载体自连么？...

是的。如果目的片段过长，可考虑用不同的酶切成几个CONTIG后再连接。
如果片段不长，那么可以考虑换一个连接试剂盒，重新回收DNA连接，全套都换新的，否则老是到处找原因也很难找的到。
赞一下 回复此楼
5楼2012-11-29 15:23:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lvye3707: 金币+5, ★有帮助, 目的片段过多有什么影响么？ 2012-11-29 19:50:39
lvye3707: 金币+25 2012-11-29 19:52:16
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2012-12-03 08:32:28
1：你用的什么酶PCR，Taq？pfu之类的高保真？后者要自己加A尾，不然连接不上T载体.
2：连接比例的问题，比例不对也容易造成载体自连.
赞一下 回复此楼
Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
6楼2012-11-29 15:45:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhjzhou

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lvye3707: 金币+5, 出现假阳性和感受态有关么？ 2012-11-29 19:51:16
引用回帖:
6楼: Originally posted by Marado at 2012-11-29 15:45:45
1：你用的什么酶PCR，Taq？pfu之类的高保真？后者要自己加A尾，不然连接不上T载体.
2：连接比例的问题，比例不对也容易造成载体自连.

是的，T载体很好连接的，主要是看你PCR的时候用的是什么酶，否则要加A才能连上，要是一般的Taq酶，就不用加A了，直接连接，一般都能连接上的，转化产物要是只长几个斑，一般不是，最起码要比较均匀的，长几十个才比较正常。
赞一下 回复此楼
7楼2012-11-29 16:57:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
lvye3707: 金币+5, ★有帮助, 谢谢，我试下 2012-12-02 20:44:57
目的片段过多影响与载体的碰撞几率，从而影响连接效率.
赞一下 回复此楼
Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
9楼2012-11-30 09:51:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 lvye3707 的主题更新
211/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 326求调剂 +4 诺贝尔化学奖觊� 2026-03-15 7/350 2026-03-16 17:11 by 诺贝尔化学奖觊�
[考研] 304求调剂 +5 素年祭语 2026-03-15 5/250 2026-03-16 17:00 by 我的船我的海
[考研] 本人考085602 化学工程 专硕 +12 不知道叫什么！ 2026-03-15 14/700 2026-03-16 16:45 by 我的船我的海
[考研] 285求调剂 +6 ytter 2026-03-12 6/300 2026-03-16 15:05 by njzyff
[基金申请] 国自科面上基金字体 +5 iwuli 2026-03-12 6/300 2026-03-16 13:13 by Kamiu_MK
[考研] 085601材料工程315分求调剂 +3 yang_0104 2026-03-15 3/150 2026-03-15 10:58 by peike
[考研] 289求调剂 +5 步川酷紫123 2026-03-11 5/250 2026-03-15 00:45 by kruisytel
[基金申请] 现在如何回避去年的某一个专家，不知道名字 +3 zk200107 2026-03-12 6/300 2026-03-14 17:13 by zk200107
[考研] 266求调剂 +4 学员97LZgn 2026-03-13 4/200 2026-03-14 08:37 by zhukairuo
[考研] 0703求调剂 +7 jtyq001 2026-03-10 7/350 2026-03-14 01:06 by JourneyLucky
[考研] 308求调剂 +3 是Lupa啊 2026-03-10 3/150 2026-03-14 00:30 by JourneyLucky
[考研] 327求调剂 +4 Ffff03 2026-03-10 4/200 2026-03-14 00:17 by JourneyLucky
[考研] 311求调剂 +5 牛乳糖的卡卡 2026-03-10 5/250 2026-03-14 00:05 by JourneyLucky
[考研] 工科材料085601 279求调剂 +8 困于星晨 2026-03-12 10/500 2026-03-13 15:42 by ms629
[考研] 工科调剂 +4 Jiang191123！ 2026-03-11 4/200 2026-03-13 15:15 by Miko19
[考研] 304求调剂（085602一志愿985） +12 化工人999 2026-03-09 12/600 2026-03-13 12:02 by JourneyLucky
[考研] 0856化工原理 +6 z2839474511 2026-03-10 6/300 2026-03-13 10:41 by houyaoxu
[考研] 化工学硕306求调剂 +9 42838695 2026-03-12 9/450 2026-03-13 10:16 by houyaoxu
[考博] 2026年博士申请 +3 QwQwQW10 2026-03-11 3/150 2026-03-12 17:58 by gxch43
[考博] 26申博求助 +3 跳跃饼干 2026-03-10 4/200 2026-03-10 21:15 by Tntcnn
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭