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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 目的片段和pMD18-T simple vector 的连接
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lvye3707

金虫 (正式写手)

[求助] 目的片段和pMD18-T simple vector 的连接已有1人参与

我做了四次了，目的片段保存在菌液里，用含有酶切位点的正向引物和反向引物扩增条带很亮，胶回收很亮，用TAKARA试剂盒连接16℃ 14--16h，转化自制的大肠杆菌DH5α，涂在氨苄抗性的板上，板上能长10+个斑，挑其中的6个，全是假阳性的，求大侠了
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1楼2012-11-28 20:56:51
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lvye3707

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by chenguestc at 2012-11-29 08:46:43
连接转化后，涂板前培养菌液后，请用通用引物和你自己的特异引物同时做菌落PCR来检测，确定连接是成功的而不是载体自连。

转化培养菌液后，我用含酶切位点的引物菌液PCR，跑出来的都是空条带，说明是载体自连么？
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4楼2012-11-29 15:00:09
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bloodwar

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lvye3707: 金币+5, ★有帮助 2012-11-29 08:37:21
你是做T-A连接的吗，含有酶切位点最好是双酶切后再连啊，用Promega的pGET载体试试吧
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2楼2012-11-29 05:18:53
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lvye3707: 金币+5, ★有帮助 2012-11-29 15:00:22
连接转化后，涂板前培养菌液后，请用通用引物和你自己的特异引物同时做菌落PCR来检测，确定连接是成功的而不是载体自连。
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3楼2012-11-29 08:46:43
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
lvye3707: 金币+5, ★有帮助, 也换过其他的试剂盒，TA克隆对PCR产物末端有要求么？ 2012-11-29 15:32:31
引用回帖:
4楼: Originally posted by lvye3707 at 2012-11-29 15:00:09
转化培养菌液后，我用含酶切位点的引物菌液PCR，跑出来的都是空条带，说明是载体自连么？...

是的。如果目的片段过长，可考虑用不同的酶切成几个CONTIG后再连接。
如果片段不长，那么可以考虑换一个连接试剂盒，重新回收DNA连接，全套都换新的，否则老是到处找原因也很难找的到。
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5楼2012-11-29 15:23:25
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