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madengyu

禁虫 (小有名气)

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张宏宇123

金虫 (著名写手)

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小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-18 15:20:43
你的质粒是多大的,酶切后应该是多大的片段?
还有就是用HindIII和NotI双酶切是0.5K+BSA,应该是1ul的K Buffer和2ul的BSA。
未来不是梦
2楼2012-05-17 17:56:11
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madengyu

禁虫 (小有名气)

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3楼2012-05-17 19:51:03
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酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-18 15:20:53
我建议你分别用HindIII和NotI做单酶切看看,是哪一个酶的酶切有问题,可能是酶失活,或者酶切条件不合适导致某一个酶的酶切失败。当然,最简单的办法是直接送质粒进行序列分析,就知道是否由序列突变导致酶切位点消失。
4楼2012-05-17 22:00:51
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张宏宇123

金虫 (著名写手)

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引用回帖:
3楼: Originally posted by madengyu at 2012-05-17 19:51:03:
pMD18-T载体 2692bp,目的基因片段 2934bp。重组质粒5692bp。
酶切后应该显示目的条带2934bp,T载体2692bp。
HindIII和NotI双酶切缓冲液是0.5K+BSA,只是各加了1ul。

你marker最大的带是多少?2700bp和2900bp很难分的。
未来不是梦
5楼2012-05-17 22:02:13
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madengyu

禁虫 (小有名气)

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6楼2012-05-17 22:07:22
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张宏宇123

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-18 18:52:22
引用回帖:
6楼: Originally posted by madengyu at 2012-05-17 22:07:22:
Marker最大是6000bp。所以感觉可能是单酶切切开了。

单切也有问题,大小有点偏大,你就楼上说的那样,用两个酶分别单酶切试试,或者用你片段内部的酶切切试试
未来不是梦
7楼2012-05-18 08:57:13
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friya0910

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流,很有道理 2012-05-18 15:21:20
做实验的时候应该设好对照,当初我做双酶切的时候都是质粒、分别单酶切、双酶切、目的片段放一起跑胶,这样出问题也能查找原因。
8楼2012-05-18 09:02:00
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叶倾意

金虫 (小有名气)

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西瓜: 金币+3, Good! 2012-05-18 18:52:47
[1]你要排除是试剂的问题,即你的酶是自己用,还是一堆人在用,要是后者,你还是重新买了,再做吧
[2]大连宝生的是TAKARA的酶么?NOT1 确实有的时候比较难切,你可以换FERMANTAS或者NEB的酶试试
[3]酶切时间有点短,我一般至少切3hr,NOT1很傲娇的。。。
[4]泡电泳的时候,除了marker,上酶切前的质粒,做阴阳性对比,才能看出所有问题。。。
自知者智 自胜者勇 自暴者弃 自强者成
9楼2012-05-18 16:49:10
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一度冰火

新虫 (初入文坛)

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★ ★
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西瓜: 金币+2, 鼓励交流~欢迎常来啊! 2012-05-18 18:52:58
我也做过双酶切,一般每种内切酶都有对应的BUFFER,如果双酶切的话就要找下两种酶的通用BUFFER,还有就是你的目的片段和PMD18-T大小很接近,建议你制胶的时候可以做2%的胶,或者酶切完跑个聚丙烯酰胺看看。
快来找我吧!
10楼2012-05-18 18:03:57
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