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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Hind111 与 Not1双酶切请教 急急急！！！
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madengyu

禁虫 (小有名气)
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1楼 2012-05-17 17:06:50
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张宏宇123

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-18 15:20:43
你的质粒是多大的，酶切后应该是多大的片段？
还有就是用HindIII和NotI双酶切是0.5K+BSA，应该是1ul的K Buffer和2ul的BSA。
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未来不是梦
2楼2012-05-17 17:56:11
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madengyu

禁虫 (小有名气)
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3楼2012-05-17 19:51:03
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酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-18 15:20:53
我建议你分别用HindIII和NotI做单酶切看看，是哪一个酶的酶切有问题，可能是酶失活，或者酶切条件不合适导致某一个酶的酶切失败。当然，最简单的办法是直接送质粒进行序列分析，就知道是否由序列突变导致酶切位点消失。
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4楼2012-05-17 22:00:51
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张宏宇123

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by madengyu at 2012-05-17 19:51:03:
pMD18-T载体 2692bp，目的基因片段 2934bp。重组质粒5692bp。
酶切后应该显示目的条带2934bp，T载体2692bp。
HindIII和NotI双酶切缓冲液是0.5K+BSA，只是各加了1ul。

你marker最大的带是多少？2700bp和2900bp很难分的。
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未来不是梦
5楼2012-05-17 22:02:13
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madengyu

禁虫 (小有名气)
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6楼2012-05-17 22:07:22
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张宏宇123

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-18 18:52:22
引用回帖:
6楼: Originally posted by madengyu at 2012-05-17 22:07:22:
Marker最大是6000bp。所以感觉可能是单酶切切开了。

单切也有问题，大小有点偏大，你就楼上说的那样，用两个酶分别单酶切试试，或者用你片段内部的酶切切试试
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未来不是梦
7楼2012-05-18 08:57:13
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friya0910

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流，很有道理 2012-05-18 15:21:20
做实验的时候应该设好对照，当初我做双酶切的时候都是质粒、分别单酶切、双酶切、目的片段放一起跑胶，这样出问题也能查找原因。
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8楼2012-05-18 09:02:00
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叶倾意

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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西瓜: 金币+3, Good！ 2012-05-18 18:52:47
[1]你要排除是试剂的问题，即你的酶是自己用，还是一堆人在用，要是后者，你还是重新买了，再做吧
[2]大连宝生的是TAKARA的酶么？NOT1 确实有的时候比较难切，你可以换FERMANTAS或者NEB的酶试试
[3]酶切时间有点短，我一般至少切3hr，NOT1很傲娇的。。。
[4]泡电泳的时候，除了marker，上酶切前的质粒，做阴阳性对比，才能看出所有问题。。。
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自知者智 自胜者勇 自暴者弃 自强者成
9楼2012-05-18 16:49:10
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一度冰火

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励交流~欢迎常来啊！ 2012-05-18 18:52:58
我也做过双酶切，一般每种内切酶都有对应的BUFFER，如果双酶切的话就要找下两种酶的通用BUFFER，还有就是你的目的片段和PMD18-T大小很接近，建议你制胶的时候可以做2%的胶，或者酶切完跑个聚丙烯酰胺看看。
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快来找我吧！
10楼2012-05-18 18:03:57
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