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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 目的片段和pMD18-T simple vector 的连接
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lvye3707

金虫 (正式写手)

[求助] 目的片段和pMD18-T simple vector 的连接 已有1人参与

我做了四次了，目的片段保存在菌液里，用含有酶切位点的正向引物和反向引物扩增条带很亮，胶回收很亮，用TAKARA试剂盒连接16℃ 14--16h，转化自制的大肠杆菌DH5α，涂在氨苄抗性的板上，板上能长10+个斑，挑其中的6个，全是假阳性的，求大侠了
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1楼 2012-11-28 20:56:51
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lvye3707: 金币+5, ★有帮助, 谢谢 2012-11-29 20:48:28
还有就是你的连接是连了十多个小时，我记得T载体连接时间挺短的啊，一般是在一个小时以内，你最好看看说明书吧~
比例的问题的话，其实应该少加载体多加片段才对~
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8楼2012-11-29 19:56:16
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wangqi20092

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lvye3707: 金币+5, ★有帮助, 春哥有用的话，我都想拜他八辈祖宗了 2012-12-02 21:46:12
第一，确定你用的PCR酶是不是在末尾加A了？第二，确定你的连接体系按说明书做的，混匀再16度连接；第三，保证你的氨苄浓度是100mg/mL，是LB培养基；第四，保证你的感受态能用；第五，转化过程确定你用的是冰浴30min，42度90s，冰2min，然后加800ul LB，不含抗生素，170rpm摇1h涂板。如果以上问题都正确，再不出来，那就拜拜春哥吧！！！
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10楼2012-11-30 10:50:46
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普通回帖

bloodwar

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lvye3707: 金币+5, ★有帮助 2012-11-29 08:37:21
你是做T-A连接的吗，含有酶切位点最好是双酶切后再连啊，用Promega的pGET载体试试吧
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2楼2012-11-29 05:18:53
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lvye3707: 金币+5, ★有帮助 2012-11-29 15:00:22
连接转化后，涂板前培养菌液后，请用通用引物和你自己的特异引物同时做菌落PCR来检测，确定连接是成功的而不是载体自连。
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3楼2012-11-29 08:46:43
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lvye3707

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by chenguestc at 2012-11-29 08:46:43
连接转化后，涂板前培养菌液后，请用通用引物和你自己的特异引物同时做菌落PCR来检测，确定连接是成功的而不是载体自连。

转化培养菌液后，我用含酶切位点的引物菌液PCR，跑出来的都是空条带，说明是载体自连么？
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4楼2012-11-29 15:00:09
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
lvye3707: 金币+5, ★有帮助, 也换过其他的试剂盒，TA克隆对PCR产物末端有要求么？ 2012-11-29 15:32:31
引用回帖:
4楼: Originally posted by lvye3707 at 2012-11-29 15:00:09
转化培养菌液后，我用含酶切位点的引物菌液PCR，跑出来的都是空条带，说明是载体自连么？...

是的。如果目的片段过长，可考虑用不同的酶切成几个CONTIG后再连接。
如果片段不长，那么可以考虑换一个连接试剂盒，重新回收DNA连接，全套都换新的，否则老是到处找原因也很难找的到。
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5楼2012-11-29 15:23:25
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lvye3707: 金币+5, ★有帮助, 目的片段过多有什么影响么？ 2012-11-29 19:50:39
lvye3707: 金币+25 2012-11-29 19:52:16
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2012-12-03 08:32:28
1：你用的什么酶PCR，Taq？pfu之类的高保真？后者要自己加A尾，不然连接不上T载体.
2：连接比例的问题，比例不对也容易造成载体自连.
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Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
6楼2012-11-29 15:45:45
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zhjzhou

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lvye3707: 金币+5, 出现假阳性和感受态有关么？ 2012-11-29 19:51:16
引用回帖:
6楼: Originally posted by Marado at 2012-11-29 15:45:45
1：你用的什么酶PCR，Taq？pfu之类的高保真？后者要自己加A尾，不然连接不上T载体.
2：连接比例的问题，比例不对也容易造成载体自连.

是的，T载体很好连接的，主要是看你PCR的时候用的是什么酶，否则要加A才能连上，要是一般的Taq酶，就不用加A了，直接连接，一般都能连接上的，转化产物要是只长几个斑，一般不是，最起码要比较均匀的，长几十个才比较正常。
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7楼2012-11-29 16:57:22
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
lvye3707: 金币+5, ★有帮助, 谢谢，我试下 2012-12-02 20:44:57
目的片段过多影响与载体的碰撞几率，从而影响连接效率.
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9楼2012-11-30 09:51:40
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