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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pcr产物胶回收浓度低，能不能和T载体连接
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weining1203

新虫 (小有名气)

[求助] pcr产物胶回收浓度低，能不能和T载体连接

小弟最近做基因克隆，目的片段2200bp，pcr产物条带亮度和2000的marker差不多，pcr体系为50ul，全部用来胶回收，回收后浓度太低，只有16ng/ul
,不知道能不能和T载体连接？ T载体为 pMD-18T  simple Vector。求大神指点
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1楼2012-09-30 21:40:23
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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你可以将你的回收产物浓缩一下！
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weining1203
持之以恒、永不放弃！
2楼2012-09-30 21:52:48
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weining1203

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by gwd0312 at 2012-09-30 21:52:48
你可以将你的回收产物浓缩一下！

怎样浓缩谢谢
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3楼2012-09-30 21:56:55
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wzqno

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-10-01 20:09:49
引用回帖:
3楼: Originally posted by weining1203 at 2012-09-30 21:56:55
怎样浓缩谢谢...

多PCR几管，可以四五个泳道的用一个回收柱回收，而且溶胶液至少通过回收柱两次，最后洗脱的时候40℃预热一下，也洗脱两次，浓度应该会高些
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4楼2012-09-30 23:20:50
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流 2012-10-01 20:10:06
不知道为什么你需要浓度更高。做连接用不了多少的吧。不知道你具体用的是什么T-vector, 20 ul连接体系放50ng载体，目的片段需要50*2.2/载体大小*3 （ng）。浓度16ng的片段你有个10 ul也足够了。
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weining1203
5楼2012-10-01 05:49:21
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weining1203

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wzqno at 2012-09-30 23:20:50
多PCR几管，可以四五个泳道的用一个回收柱回收，而且溶胶液至少通过回收柱两次，最后洗脱的时候40℃预热一下，也洗脱两次，浓度应该会高些...

谢谢
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6楼2012-10-01 08:29:33
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weining1203

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-01 05:49:21
不知道为什么你需要浓度更高。做连接用不了多少的吧。不知道你具体用的是什么T-vector, 20 ul连接体系放50ng载体，目的片段需要50*2.2/载体大小*3 （ng）。浓度16ng的片段你有个10 ul也足够了。

T载体为 pMD-18T  simple Vector，说明书连接体系只有5ul：                                  Vector         1ul（50ng）
                                                          insert   dna            X ul
                                                                   d水       up to 5ul
就算加4ul的dna，浓度不过64ng，可说明书要求Vector ：insert dna为1:2-10，是不是只能提高胶回收的浓度啦，求指点
另外，说明说Insert DNA的使用量（ng）= nmol数*660*insert dna的bp数，这个nmol数是质粒的还是dna的，怎么知道他的mol数
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7楼2012-10-01 08:44:25
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jlwang201

禁虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
8楼2012-10-01 12:14:35
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weining1203

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by jlwang201 at 2012-10-01 12:14:35
可以，除了质粒，其他全部加成你的目标条带溶液，我以前做过！

谢谢
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9楼2012-10-01 19:17:57
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jw1985629

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
要看亮度，对比着marker来看，基本上不弱于marker就可以，跟它一样亮貌似就知道包含多少核酸量了，具体数我忘记了
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i still have so much to do
10楼2012-10-01 23:13:33
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