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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR产物回收之后跑胶浓度过低
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shuifen1108

金虫 (正式写手)

[求助] PCR产物回收之后跑胶浓度过低

PCR之后，切胶，用Takara回收胶试剂盒回收的，结果跑胶之后发现浓度很低，请教各位大侠，能不能用于下一步的PCR？切还有就是回收产率低的原因有哪些？完胶之后放入-20度保存一段时间再回收，会对回收产率有影响吗？注明所用的marker DL2000,4ul，样品每个3ul。





[ Last edited by shuifen1108 on 2011-11-2 at 20:09 ]
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1楼2011-11-02 20:06:22
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

shuifen1108

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-11-02 21:39:53:
仔细看看试剂盒的说明书，上面会有详细的问题说明。Takara家的说明书编得还是不错滴
[ Last edited by 西瓜 on 2011-11-2 at 21:44 ]

按照说明书一步步来的，而且第一步溶解胶的时候还特别小心，加热了15min左右才开始往下做的，所以胶肯定完全溶解了，下面都很简单，以前没出现过这种情况，会不会试剂盒有问题，买了好久了。3Q
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5楼2011-11-02 22:35:17
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longrna

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
shuifen1108(金币+1): 2011-11-03 11:24:32
西瓜(金币+3): good 2011-11-05 21:58:54
1.可能你本身PCR产物都不是很亮，这一点你可以多扩几管PCR解决。
2.胶回收是有一个回收率的问题，一般在50-70%，如果你只扩到了100ngPCR产物，那经跑胶再切胶再过柱回收，估计能得到50ng也就不错了。。。
3.溶胶时间的确不需那么长，充分溶了即可，溶胶液时间过久一般对DNA有损伤。
4.联系Takara技术支持寻求帮助。
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伟大航线....
8楼2011-11-03 10:28:54
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普通回帖

wcwluwei

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
2楼2011-11-02 21:22:40
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wcwluwei

禁虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
wanhscn(金币+4): 鼓励新虫多发贴！鼓励多来分子生物版！有奖励！ 2011-11-02 21:24:55
wanhscn(金币+1): 鼓励应助！ 2011-11-02 21:25:03
shuifen1108(金币+2): 2011-11-03 11:23:51
本帖内容被屏蔽
3楼2011-11-02 21:24:03
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
仔细看看试剂盒的说明书，上面会有详细的问题说明。Takara家的说明书编得还是不错滴

[ Last edited by 西瓜 on 2011-11-2 at 21:44 ]
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4楼2011-11-02 21:39:53
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shuifen1108

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wcwluwei at 2011-11-02 21:22:40:
胶跑得真一般啊  怎么拍的照啊！  晕   用来PCR是没问题的，一点浓度就可以的。

关键是回收之后的浓度真的很低，我也没得办法啊。marker跑的还可以吧，真有你说的那么差吗
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6楼2011-11-02 22:37:26
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Constig

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

shuifen1108(金币+2): 2011-11-03 11:24:14
引用回帖:
5楼: Originally posted by shuifen1108 at 2011-11-02 22:35:17:
按照说明书一步步来的，而且第一步溶解胶的时候还特别小心，加热了15min左右才开始往下做的，所以胶肯定完全溶解了，下面都很简单，以前没出现过这种情况，会不会试剂盒有问题，买了好久了。3Q

溶胶的时间太长会对DNA片段有损伤的，另外回收试剂盒的损失率都会很高。不过如果只是用来PCR的话，完全没有问题的。
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让我们用微笑面对苦难吧
7楼2011-11-03 09:51:52
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shuifen1108

金虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by longrna at 2011-11-03 10:28:54:
1.可能你本身PCR产物都不是很亮，这一点你可以多扩几管PCR解决。
2.胶回收是有一个回收率的问题，一般在50-70%，如果你只扩到了100ngPCR产物，那经跑胶再切胶再过柱回收，估计能得到50ng也就不错了。。。
3.溶胶 ...

可能真的是我溶胶时间太长了，害怕没有完全溶解，造成回收率降低，没想到过犹不及啊，谢谢
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9楼2011-11-03 11:23:21
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shuifen1108

金虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by longrna at 2011-11-03 10:28:54:
1.可能你本身PCR产物都不是很亮，这一点你可以多扩几管PCR解决。
2.胶回收是有一个回收率的问题，一般在50-70%，如果你只扩到了100ngPCR产物，那经跑胶再切胶再过柱回收，估计能得到50ng也就不错了。。。
3.溶胶 ...

I am sorry,本来想给三个金币的  结果只剩下一个了，非常对不起啊。
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10楼2011-11-03 11:25:28
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