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weining1203

新虫 (小有名气)

[求助] pcr产物胶回收浓度低,能不能和T载体连接

小弟最近做基因克隆,目的片段2200bp,pcr产物条带亮度和2000的marker差不多,pcr体系为50ul,全部用来胶回收,回收后浓度太低,只有16ng/ul
,不知道能不能和T载体连接? T载体为 pMD-18T  simple Vector。求大神指点
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weining1203

新虫 (小有名气)

送鲜花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-01 05:49:21
不知道为什么你需要浓度更高。做连接用不了多少的吧。不知道你具体用的是什么T-vector, 20 ul连接体系放50ng载体,目的片段需要50*2.2/载体大小*3 (ng)。浓度16ng的片段你有个10 ul也足够了。

T载体为 pMD-18T  simple Vector,说明书连接体系只有5ul:                                  Vector         1ul(50ng)
                                                          insert   dna            X ul
                                                                   d水       up to 5ul
就算加4ul的dna,浓度不过64ng,可说明书要求Vector :insert dna为1:2-10,是不是只能提高胶回收的浓度啦,求指点
另外,说明说Insert DNA的使用量(ng)= nmol数*660*insert dna的bp数,这个nmol数是质粒的还是dna的,怎么知道他的mol数
7楼2012-10-01 08:44:25
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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你可以将你的回收产物浓缩一下!

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

持之以恒、永不放弃!
2楼2012-09-30 21:52:48
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weining1203

新虫 (小有名气)

送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by gwd0312 at 2012-09-30 21:52:48
你可以将你的回收产物浓缩一下!

怎样浓缩谢谢
3楼2012-09-30 21:56:55
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wzqno

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-10-01 20:09:49
引用回帖:
3楼: Originally posted by weining1203 at 2012-09-30 21:56:55
怎样浓缩谢谢...

多PCR几管,可以四五个泳道的用一个回收柱回收,而且溶胶液至少通过回收柱两次,最后洗脱的时候40℃预热一下,也洗脱两次,浓度应该会高些
4楼2012-09-30 23:20:50
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