应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 目的片段和pMD18-T simple vector 的连接
211/3返回列表123下一页
查看: 3486  |  回复: 20
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

lvye3707

金虫 (正式写手)

[求助] 目的片段和pMD18-T simple vector 的连接 已有1人参与

我做了四次了，目的片段保存在菌液里，用含有酶切位点的正向引物和反向引物扩增条带很亮，胶回收很亮，用TAKARA试剂盒连接16℃ 14--16h，转化自制的大肠杆菌DH5α，涂在氨苄抗性的板上，板上能长10+个斑，挑其中的6个，全是假阳性的，求大侠了
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

实验操作

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-11-28 20:56:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lvye3707: 金币+5, ★有帮助, 谢谢 2012-11-29 20:48:28
还有就是你的连接是连了十多个小时，我记得T载体连接时间挺短的啊，一般是在一个小时以内，你最好看看说明书吧~
比例的问题的话，其实应该少加载体多加片段才对~
赞一下(1人) 回复此楼
8楼2012-11-29 19:56:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wangqi20092

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lvye3707: 金币+5, ★有帮助, 春哥有用的话，我都想拜他八辈祖宗了 2012-12-02 21:46:12
第一，确定你用的PCR酶是不是在末尾加A了？第二，确定你的连接体系按说明书做的，混匀再16度连接；第三，保证你的氨苄浓度是100mg/mL，是LB培养基；第四，保证你的感受态能用；第五，转化过程确定你用的是冰浴30min，42度90s，冰2min，然后加800ul LB，不含抗生素，170rpm摇1h涂板。如果以上问题都正确，再不出来，那就拜拜春哥吧！！！
赞一下(1人) 回复此楼
10楼2012-11-30 10:50:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

bloodwar

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lvye3707: 金币+5, ★有帮助 2012-11-29 08:37:21
你是做T-A连接的吗，含有酶切位点最好是双酶切后再连啊，用Promega的pGET载体试试吧
赞一下 回复此楼
2楼2012-11-29 05:18:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lvye3707: 金币+5, ★有帮助 2012-11-29 15:00:22
连接转化后，涂板前培养菌液后，请用通用引物和你自己的特异引物同时做菌落PCR来检测，确定连接是成功的而不是载体自连。
赞一下 回复此楼
3楼2012-11-29 08:46:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lvye3707

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by chenguestc at 2012-11-29 08:46:43
连接转化后，涂板前培养菌液后，请用通用引物和你自己的特异引物同时做菌落PCR来检测，确定连接是成功的而不是载体自连。

转化培养菌液后，我用含酶切位点的引物菌液PCR，跑出来的都是空条带，说明是载体自连么？
赞一下 回复此楼
4楼2012-11-29 15:00:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
lvye3707: 金币+5, ★有帮助, 也换过其他的试剂盒，TA克隆对PCR产物末端有要求么？ 2012-11-29 15:32:31
引用回帖:
4楼: Originally posted by lvye3707 at 2012-11-29 15:00:09
转化培养菌液后，我用含酶切位点的引物菌液PCR，跑出来的都是空条带，说明是载体自连么？...

是的。如果目的片段过长，可考虑用不同的酶切成几个CONTIG后再连接。
如果片段不长，那么可以考虑换一个连接试剂盒，重新回收DNA连接，全套都换新的，否则老是到处找原因也很难找的到。
赞一下 回复此楼
5楼2012-11-29 15:23:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lvye3707: 金币+5, ★有帮助, 目的片段过多有什么影响么？ 2012-11-29 19:50:39
lvye3707: 金币+25 2012-11-29 19:52:16
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2012-12-03 08:32:28
1：你用的什么酶PCR，Taq？pfu之类的高保真？后者要自己加A尾，不然连接不上T载体.
2：连接比例的问题，比例不对也容易造成载体自连.
赞一下 回复此楼
Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
6楼2012-11-29 15:45:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhjzhou

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lvye3707: 金币+5, 出现假阳性和感受态有关么？ 2012-11-29 19:51:16
引用回帖:
6楼: Originally posted by Marado at 2012-11-29 15:45:45
1：你用的什么酶PCR，Taq？pfu之类的高保真？后者要自己加A尾，不然连接不上T载体.
2：连接比例的问题，比例不对也容易造成载体自连.

是的，T载体很好连接的，主要是看你PCR的时候用的是什么酶，否则要加A才能连上，要是一般的Taq酶，就不用加A了，直接连接，一般都能连接上的，转化产物要是只长几个斑，一般不是，最起码要比较均匀的，长几十个才比较正常。
赞一下 回复此楼
7楼2012-11-29 16:57:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
lvye3707: 金币+5, ★有帮助, 谢谢，我试下 2012-12-02 20:44:57
目的片段过多影响与载体的碰撞几率，从而影响连接效率.
赞一下 回复此楼
Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
9楼2012-11-30 09:51:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 lvye3707 的主题更新
211/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 jCd0dEvKHShX 2026-08-29 6/300 2026-08-31 02:45 by hZiFeudZyoGR
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 jCd0dEvKHShX 2026-08-29 5/250 2026-08-31 02:13 by hZiFeudZyoGR
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 G6APbkg8SA6w 2026-08-29 6/300 2026-08-31 01:48 by hZiFeudZyoGR
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 5/250 2026-08-31 01:27 by hZiFeudZyoGR
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +6 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 8/400 2026-08-31 01:26 by hZiFeudZyoGR
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +7 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 12/600 2026-08-31 00:34 by hZiFeudZyoGR
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +7 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 12/600 2026-08-31 00:31 by hZiFeudZyoGR
[考博] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 4FFAWE8HcgUD 2026-08-29 3/150 2026-08-30 20:19 by hZiFeudZyoGR
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 zICmwzsBXjbN 2026-08-29 5/250 2026-08-30 20:08 by hZiFeudZyoGR
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 jCd0dEvKHShX 2026-08-29 4/200 2026-08-30 19:57 by hZiFeudZyoGR
[找工作] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 jCd0dEvKHShX 2026-08-29 5/250 2026-08-30 19:48 by hZiFeudZyoGR
[博后之家] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +8 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 9/450 2026-08-30 11:40 by l0VvVHGBGRLv
[基金申请] 麻烦专家们看看评委们的意见（F口面上） +6 gdd2018 2026-08-28 11/550 2026-08-30 08:58 by 超级无敌华子
[教师之家] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 8/400 2026-08-30 05:48 by ZPa0EcMwuECS
[基金申请] 申请删除本帖 +6 lyz123lyz 2026-08-27 7/350 2026-08-27 17:31 by 宁静致远sy
[基金申请] 看板上这么多中的，有点像50人群里49个人都是骗子的那种感觉…… +5 a089 2026-08-26 6/300 2026-08-27 14:05 by jonewore
[文学芳草园] 梦想 +3 myrtle 2026-08-26 3/150 2026-08-27 10:01 by angelyueyi
[基金申请] 出来了 +9 trojank 2026-08-26 9/450 2026-08-26 14:25 by 宝贝虫子
[基金申请] 为什么国自然不能直接公布 +4 bjdxyxy 2026-08-26 4/200 2026-08-26 13:12 by qingmu1201
[基金申请] 某些机构，以效率低为荣，以效率低作为存在感 +9 yuleib84 2026-08-25 10/500 2026-08-25 17:14 by alexon
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭