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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 目的片段和pMD18-T simple vector 的连接
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lvye3707

金虫 (正式写手)

[求助] 目的片段和pMD18-T simple vector 的连接已有1人参与

我做了四次了，目的片段保存在菌液里，用含有酶切位点的正向引物和反向引物扩增条带很亮，胶回收很亮，用TAKARA试剂盒连接16℃ 14--16h，转化自制的大肠杆菌DH5α，涂在氨苄抗性的板上，板上能长10+个斑，挑其中的6个，全是假阳性的，求大侠了
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1楼2012-11-28 20:56:51
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zhjzhou

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lvye3707: 金币+5, 出现假阳性和感受态有关么？ 2012-11-29 19:51:16
引用回帖:
6楼: Originally posted by Marado at 2012-11-29 15:45:45
1：你用的什么酶PCR，Taq？pfu之类的高保真？后者要自己加A尾，不然连接不上T载体.
2：连接比例的问题，比例不对也容易造成载体自连.

是的，T载体很好连接的，主要是看你PCR的时候用的是什么酶，否则要加A才能连上，要是一般的Taq酶，就不用加A了，直接连接，一般都能连接上的，转化产物要是只长几个斑，一般不是，最起码要比较均匀的，长几十个才比较正常。
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7楼2012-11-29 16:57:22
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bloodwar

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lvye3707: 金币+5, ★有帮助 2012-11-29 08:37:21
你是做T-A连接的吗，含有酶切位点最好是双酶切后再连啊，用Promega的pGET载体试试吧
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2楼2012-11-29 05:18:53
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lvye3707: 金币+5, ★有帮助 2012-11-29 15:00:22
连接转化后，涂板前培养菌液后，请用通用引物和你自己的特异引物同时做菌落PCR来检测，确定连接是成功的而不是载体自连。
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3楼2012-11-29 08:46:43
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lvye3707

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by chenguestc at 2012-11-29 08:46:43
连接转化后，涂板前培养菌液后，请用通用引物和你自己的特异引物同时做菌落PCR来检测，确定连接是成功的而不是载体自连。

转化培养菌液后，我用含酶切位点的引物菌液PCR，跑出来的都是空条带，说明是载体自连么？
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4楼2012-11-29 15:00:09
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