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lvye3707

金虫 (正式写手)

[求助] 目的片段和pMD18-T simple vector 的连接 已有1人参与

我做了四次了,目的片段保存在菌液里,用含有酶切位点的正向引物和反向引物扩增条带很亮,胶回收很亮,用TAKARA试剂盒连接16℃ 14--16h,转化自制的大肠杆菌DH5α,涂在氨苄抗性的板上,板上能长10+个斑,挑其中的6个,全是假阳性的,求大侠了
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wangqi20092

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
lvye3707: 金币+5, 有帮助, 春哥有用的话,我都想拜他八辈祖宗了 2012-12-02 21:46:12
第一,确定你用的PCR酶是不是在末尾加A了?第二,确定你的连接体系按说明书做的,混匀再16度连接;第三,保证你的氨苄浓度是100mg/mL,是LB培养基;第四,保证你的感受态能用;第五,转化过程确定你用的是冰浴30min,42度90s,冰2min,然后加800ul LB,不含抗生素,170rpm摇1h涂板。如果以上问题都正确,再不出来,那就拜拜春哥吧!!!
10楼2012-11-30 10:50:46
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bloodwar

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
lvye3707: 金币+5, 有帮助 2012-11-29 08:37:21
你是做T-A连接的吗,含有酶切位点最好是双酶切后再连啊,用Promega的pGET载体试试吧
2楼2012-11-29 05:18:53
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
lvye3707: 金币+5, 有帮助 2012-11-29 15:00:22
连接转化后,涂板前培养菌液后,请用通用引物和你自己的特异引物同时做菌落PCR来检测,确定连接是成功的而不是载体自连。
3楼2012-11-29 08:46:43
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lvye3707

金虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by chenguestc at 2012-11-29 08:46:43
连接转化后,涂板前培养菌液后,请用通用引物和你自己的特异引物同时做菌落PCR来检测,确定连接是成功的而不是载体自连。

转化培养菌液后,我用含酶切位点的引物菌液PCR,跑出来的都是空条带,说明是载体自连么?
4楼2012-11-29 15:00:09
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