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lvye3707

金虫 (正式写手)

[求助] 目的片段和pMD18-T simple vector 的连接已有1人参与

我做了四次了,目的片段保存在菌液里,用含有酶切位点的正向引物和反向引物扩增条带很亮,胶回收很亮,用TAKARA试剂盒连接16℃ 14--16h,转化自制的大肠杆菌DH5α,涂在氨苄抗性的板上,板上能长10+个斑,挑其中的6个,全是假阳性的,求大侠了
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
lvye3707: 金币+5, 有帮助, 目的片段过多有什么影响么? 2012-11-29 19:50:39
lvye3707: 金币+25 2012-11-29 19:52:16
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2012-12-03 08:32:28
1:你用的什么酶PCR,Taq?pfu之类的高保真?后者要自己加A尾,不然连接不上T载体.
2:连接比例的问题,比例不对也容易造成载体自连.
Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
6楼2012-11-29 15:45:45
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查看全部 21 个回答

bloodwar

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
lvye3707: 金币+5, 有帮助 2012-11-29 08:37:21
你是做T-A连接的吗,含有酶切位点最好是双酶切后再连啊,用Promega的pGET载体试试吧
2楼2012-11-29 05:18:53
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
lvye3707: 金币+5, 有帮助 2012-11-29 15:00:22
连接转化后,涂板前培养菌液后,请用通用引物和你自己的特异引物同时做菌落PCR来检测,确定连接是成功的而不是载体自连。
3楼2012-11-29 08:46:43
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lvye3707

金虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by chenguestc at 2012-11-29 08:46:43
连接转化后,涂板前培养菌液后,请用通用引物和你自己的特异引物同时做菌落PCR来检测,确定连接是成功的而不是载体自连。

转化培养菌液后,我用含酶切位点的引物菌液PCR,跑出来的都是空条带,说明是载体自连么?
4楼2012-11-29 15:00:09
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