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pET28a双酶切后连接目的基因，什么也不长。。。
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1.pET28a提出来时分子量就很大，8kb左右，不知道为什么提出来的质粒分子量就狠大，但双酶切后在5.5kb左右。见电泳图：左边到右分为为：marker（三条亮带分别为6000 3000 1000） 双切后质粒 未酶切的质粒 双切后的目的基因（1.5kb） 2.我用SacI和HindIII双酶切，体系20ul,10*tango buffer 2ul,质粒DNA 16ul,SacI 1ul,HindIII 1ul.切出来的条带在5.5kb左右。目的基因是从T载体上切下来的，20ul体系和质粒双酶切一样，就把质粒DNA换成目的基因16ul.电泳显示是切开了的。37度酶切6小时。 3.10ul的连接体系：目的基因7ul,载体1.5ul,10*buffer 1ul,T4连接酶 0.5ul.4度过夜连接，什么也不长，我还设置了对照组，感受态组：什么也不转，长得很好，说明感受态没问题。质粒自连组：质粒 2ul，ddH2O 6.5ul,10*buffer 1ul,T4连接酶 0.5ul.什么也不长。双切后的线性质粒转化，5ul的线性质粒转化100ul感受态，也什么都不长。。。 重复好几次了都不长，快崩溃了。。。  101_0045.JPG |
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gyesang: 回帖置顶 2013-04-28 17:32:56
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我的连接做出来了，在此分享下，希望能帮到遇到同样问题的同学 1.我的质粒提出来大小不对，可能就是构想不同的原因，虽然我前几次提的都是这么大，但有一次我提出来的质粒大小事对的，在5,6k左右。但之前分子量大的质粒不影响后续试验 2.我之前一直连接不上市因为我的片段浓度都太小了，双酶切完跑胶时条带也不是很亮，回收损失一部分就更少了，后来加大上样量，DNA片段浓度提高了，就连上了，虽然就长了两个菌落，但都是阳性的，呵呵，目前不知道为啥连接效率这么低，空质粒转感受态的效率很高，所以应该不会是感受态的问题。希望大侠们帮我分析下原因，接下来还要连第二个基因，不想连接效率还是这么低啊 无论怎样，只要连上就好 |
16楼2013-03-07 15:57:07
piaoyunokok
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2楼2013-03-02 11:03:32
cicelyzh
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【答案】应助回帖
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witeness(myprayer代发): 金币+2, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-04-14 15:31:07
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你做了很多对照，但是转化最关键的是需要做一个阳性对照和阴性对照。你把感受态什么都不转，涂的是无抗性的板子吧，否则不能长得很好。这个并不能说明感受态没问题，只能说明感受态细胞复苏得不错。是否具备感受性需要用感受态细胞转一个抗性相同的质粒，能转进去才说明感受态好用，这是我提到的阳性对照。阴性对照应该是感受态什么都不转涂抗性板，说明感受态细胞没有污染，抗性平板筛选压力足够。 我有些不明白你说的质粒自连是什么。质粒肯定可以转进去的，即使加了连接酶什么的，并不影响后面的转化。做这个对照的意义是什么呢？ 对于线性载体，有人做这个对照，一般是把双酶切的线性载体自连后转化。如果出现很多克隆，说明酶切不完全。 |
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witeness3楼2013-03-02 13:20:24
cicelyzh
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4楼2013-03-02 13:22:25