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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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guowei927111

金虫 (小有名气)

[求助] 大片段连接pET-28a表达载体

最近在做一个长6.9kb的目的片段连接pET-28a载体,连了几次没有连上,请问高手们有什么好办法没啊?
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再接再厉
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
加大片段浓度,16度过夜连接
jiayoubashaonian
2楼2012-03-30 22:12:31
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

做过很多连接,但是最没信心做的就是大片段连接,特别是当片段与载体大小相近,或比片段还大时,这种连接基本都不大敢做。同问,看有没有这方面有经验的虫子。
Thank-you,so-blue.
3楼2012-03-31 09:32:01
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whb21

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
可以适当增加片段的用量和酶的用量试试
4楼2012-03-31 10:04:37
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zx6291

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
目的片段回收产物 6.5 uL
pET-28a酶切回收产物  1 uL
Solution I  7.5uL
16度 3小时
应该就可以了
5楼2012-03-31 10:48:55
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guowei927111

金虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by zx6291 at 2012-03-31 10:48:55:
目的片段回收产物 6.5 uL
pET-28a酶切回收产物  1 uL
Solution I  7.5uL
16度 3小时
应该就可以了

你说的SolutionI是连接T载体用的那个吗?
再接再厉
6楼2012-03-31 10:59:35
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zx6291

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

是的,SolutionI为TAKARA公司产品,并不仅用于连接T载体,我们现在做连接都用它,效率比T4连接酶要高。
7楼2012-03-31 11:27:45
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bffgbgff

新虫 (小有名气)

大片段链接,不能加大浓度,应该减小浓度。当载体和片段大小相近的时候,摩尔比,片段:载体= 1:1 或者1:2,试试吧,good luck !
8楼2012-03-31 12:40:42
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churchill87426

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
其实觉得Takara的SolutionI和T4效率都一般,不如Promega的T4。个人感觉而已。
9楼2012-03-31 17:57:32
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