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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » SDS-PAGE中蛋白条带位置不一致
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)

[求助] SDS-PAGE中蛋白条带位置不一致

前后几次SDS-PAGE中，同样的样品跑出来的蛋白条带位置与Marker对比不一样，第一次跑的时候，我要的目的蛋白条带与Marker 的25 kd 的带几乎一样大，但是后来跑的时候那条带又比Marker 25 KD 的带大了，在它上边，哪位大侠知道这是什么原因呀？！
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1楼 2013-10-23 09:35:08
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-24 00:31:07
如果没有改变电泳胶和缓冲溶液的浓度和类型，那么最有可能是你的样品蛋白质有凝聚或者共价修饰出现或较大的构象改变，Marker存在降解或较大的构象改变。检测构象改变的方法可以用红外、紫外对比不同批次的样品和Marker，检测是否有降解降解或者共价修饰可用质谱检测不同批次的样品和Marker。
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2楼2013-10-23 10:40:00
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

如果真的形成分子间的二硫键或酰胺键或者其他的共价键，SDS是不可能对其加以断裂和直接的阻止分子间的二硫键或酰胺键的形成的；因为要可能形成分子间的二硫键或酰胺键的氨基酸侧链基团在变性的蛋白质中处于分子表面，而且PH和反应物浓度合适又处于溶液环境和暴露于空气中，SDS是不可能阻碍两个巯基氧化为一个二硫键和羧基与氨基形成酰胺键。SDS使得蛋白质变性成为直的杆状分子倒是有可能在一定程度上消除球形蛋白质的空间位阻，当然SDS结合上蛋白质表面有形成新的空间位阻，但是SDS不可能每时每刻都结合在蛋白质的表面，而且对于杆状的蛋白质的末端SDS是封堵不住的。再有，蛋白质也许原来就有二硫键存在，SDS本身是不可能打开二硫键的，当然如果上样时加上DTT，巯基乙醇当然能打开二硫键，但是SDS-PAGE不是一定要加上DTT，巯基乙醇，楼主也没有提供此种信息。

何况即使加了DTT，巯基乙醇，酰胺键在一定条件下还是会形成，与SDS无关。

所以4楼的说法不对！

其他的共价键情况很复杂，这里不讨论。
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8楼2013-10-24 01:19:59
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-10-23 10:40:00
如果没有改变电泳胶和缓冲溶液的浓度和类型，那么最有可能是你的样品蛋白质有凝聚或者共价修饰出现或较大的构象改变，Marker存在降解或较大的构象改变。检测构象改变的方法可以用红外、紫外对比不同批次的样品和Mar ...

额，这样啊，我同学的蛋白条带也是这样，难道我们的样品都有问题了？
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3楼2013-10-23 12:16:58
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20083630zhan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-24 00:31:23
不可能是蛋白质凝聚产生的，因为你做SDS-PAGE时，你已经将你的目的蛋白变性，因此不存在分子间的二硫键，也更无分子间构象改变一说，如果实在你要确定你的蛋白的分子量，那么你可以做迁移率实验，将你的蛋白Marker 做迁移率试验，得到标曲，然后再用你的目的蛋白做迁移率实验，再通过标曲找到对应的分子量
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4楼2013-10-23 22:42:04
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 20083630zhan at 2013-10-23 22:42:04
不可能是蛋白质凝聚产生的，因为你做SDS-PAGE时，你已经将你的目的蛋白变性，因此不存在分子间的二硫键，也更无分子间构象改变一说，如果实在你要确定你的蛋白的分子量，那么你可以做迁移率实验，将你的蛋白Marker  ...

SDS会引起蛋白质变性不假，但是SDS会引起蛋白质的螺旋构象增加而不是减少！变性本身不会断裂二硫键！SDS更不会！
蛋白质分子间的非共价的凝聚作用应该不大可能，但是共价修饰和二硫键连接是可能的，只要在空气中蛋白质的游离巯基就会氧化成二硫键，SDS无法阻止蛋白质的游离巯基就会氧化成二硫键，DTT和巯基乙醇才能解开二硫键。所以蛋白质分子间凝聚是可能的！
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5楼2013-10-24 00:58:34
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
蛋白质的变性是不会断裂共价键的，SDS更不会！
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6楼2013-10-24 00:59:38
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

要确定分子量改变最精确的办法是用质谱，而不是凝胶电泳！

如果形成分子间的二硫键或酰胺键或者其他的共价键，那么无论是不是有SDS存在，蛋白质的构象都会改变。不同的蛋白质的序列的变性状态不可能完全一样，何况如果出现肽链的分支！SDS至少肽链分支处不可能与为分支的结合是一样的。
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7楼2013-10-24 01:04:53
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avex514

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-10-24 00:58:34
SDS会引起蛋白质变性不假，但是SDS会引起蛋白质的螺旋构象增加而不是减少！变性本身不会断裂二硫键！SDS更不会！
蛋白质分子间的非共价的凝聚作用应该不大可能，但是共价修饰和二硫键连接是可能的，只要在空气中蛋 ...

如果loading buffer里面加了巯基乙醇的话，就不会存在二硫键形成的问题吧
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9楼2013-10-24 09:52:27
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
引用回帖:
9楼: Originally posted by avex514 at 2013-10-24 09:52:27
如果loading buffer里面加了巯基乙醇的话，就不会存在二硫键形成的问题吧...

这同样有一个具体β-巯基乙醇的量的问题，不是非黑即白的问题，而且β-巯基乙醇不能阻止酰胺键的形成。
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10楼2013-10-24 23:11:24
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