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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 求解：纯化蛋白跑SDS-PAGE，没有条带
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715097730

铜虫 (小有名气)

[求助] 求解：纯化蛋白跑SDS-PAGE，没有条带 已有1人参与

各位大神，小妹现在遇到一大难题。
我有一株野生菌产我要的酶，发酵后我对粗酶液进行了盐析和透析，然后过了强阴离子柱，再把洗脱的蛋白冻干后用tris复溶，浓度大约300微克/毫升。之后就想做一个SDS-PAGE看看蛋白纯不纯，还有它的分子量。
分离胶和浓缩胶分别是12%和5%，但是就是没有条带，可是Marker是有条带的。不知道是什么原因，跪求各位能够解答！！！！！！！
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1楼 2013-10-04 19:17:51
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
715097730: 金币+20, ★有帮助 2013-10-11 15:46:00
引用回帖:
6楼: Originally posted by 715097730 at 2013-10-05 12:03:07
我是用60％-80％硫酸铵盐析的，透析后的样品是有酶活的，而且过完离子交换柱的样品也是有酶活的。不知道问题到底出在哪里，就是没有条带
...

如果做SDS-PAGE的样品有酶活，但是看不到蛋白条带，可能是样品不纯，上样量不够。还有可能是有其它蛋白或者杂质干扰酶活测定。
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7楼2013-10-06 00:39:37
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普通回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+1, 鼓励应助！ 2013-10-11 19:23:32
你通过什么方法检测你要的酶，测酶活吗？你可以分别监测纯化前的粗酶液、纯化过程中的各个组分的酶活，确定酶是否在纯化过程中丢失或者失活。
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2楼2013-10-04 22:21:41
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lmqml24

禁虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
715097730: 金币+10 2013-10-11 15:47:03
laozuzunzhe: 金币+2, 鼓励应助！ 2013-10-11 19:23:42
本帖内容被屏蔽
3楼2013-10-04 23:49:43
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匿名

用户注销 (初入文坛)
感谢参与，应助指数 +1
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4楼2013-10-05 10:46:12
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715097730

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-10-04 22:21:41
你通过什么方法检测你要的酶，测酶活吗？你可以分别监测纯化前的粗酶液、纯化过程中的各个组分的酶活，确定酶是否在纯化过程中丢失或者失活。

每个过程都有测酶活的，蛋白不会完全丢失

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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5楼2013-10-05 11:56:03
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715097730

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lmqml24 at 2013-10-04 23:49:43
纯化的每一步都应该用SDS－PAGE检测下的，这样既能判断纯化的效果，又能对目标条带进行跟踪。另外，透析时间较长，酶易失活。不知楼主是否对该酶的特性已知，盐析沉淀的浓度大的话，可以考虑疏水交换层析；浓度小的 ...

我是用60％-80％硫酸铵盐析的，透析后的样品是有酶活的，而且过完离子交换柱的样品也是有酶活的。不知道问题到底出在哪里，就是没有条带

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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6楼2013-10-05 12:03:07
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lmqml24

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
8楼2013-10-06 13:05:18
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felling_123

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
715097730: 金币+10 2013-10-11 15:46:19
建议增加样品的浓度（该样品浓度的5~10倍），因为你的样品“300ug/ml“不一定是实际浓度，某些蛋白浓度测定方法对低浓度蛋白测定误差大，低浓度的样品是看不见条带的。祝你好运
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不进则退，时刻努力
9楼2013-10-06 15:26:31
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alarace

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
有可能蛋白的量比较低，所以看不得目的蛋白条带，可以用银染试试
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10楼2013-10-06 16:11:39
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