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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » SDS-PAGE跑膜蛋白为什么会这样
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kikiwitch

新虫 (初入文坛)

[交流] SDS-PAGE跑膜蛋白为什么会这样 已有3人参与

第一次跑膜蛋白，用的是TRITON 来溶解的，用的是10%的胶，为什么感觉大部分蛋白都挤在上部分了。

另外，因为我要检测的是cytochrome，细胞色素在菌体的的表达，所以用专门的方法染了一下细胞色素，见下图，从左到右2，4两条是我的sample，其他是control（没有转质粒进去的野生菌株），感觉确实蓝色条带加深了，但都挤在了胶最上方，不知道为什么。

新手发帖，没有金币悬赏，实在抱歉啊。
SDS-PAGE跑膜蛋白为什么会这样
SDS.jpg


SDS-PAGE跑膜蛋白为什么会这样-1
heme staining.jpg

[ Last edited by kikiwitch on 2013-5-23 at 16:28 ]
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1楼 2013-05-23 16:27:03
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lzjessie_wlf

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2楼: Originally posted by edoz1986 at 2013-05-23 17:12:01
你的膜蛋白应该没有提取出来，还是在细胞膜上吧！在对膜蛋白进行纯化和纯化的时候，要用去污剂将蛋白与细胞膜进行分离，并在去污剂溶解的状态下进行纯化，纯化后膜蛋除去白去污剂再进行重构。你用的triton应该不能（ ...

怎么去除去污剂呀。
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7楼2013-05-23 21:39:57
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edoz1986

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7楼: Originally posted by lzjessie_wlf at 2013-05-23 21:39:57
怎么去除去污剂呀。...

用普通ｂｕｆｆｅｒ洗柱子就好了啊
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8楼2013-05-23 22:04:11
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edoz1986

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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-23 18:47:08
你的膜蛋白应该没有提取出来，还是在细胞膜上吧！在对膜蛋白进行纯化和纯化的时候，要用去污剂将蛋白与细胞膜进行分离，并在去污剂溶解的状态下进行纯化，纯化后膜蛋除去白去污剂再进行重构。你用的triton应该不能（或很少）提取溶解吧！
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2楼2013-05-23 17:12:01
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edoz1986

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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-23 18:48:02
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2楼: Originally posted by edoz1986 at 2013-05-23 17:12:01
你的膜蛋白应该没有提取出来，还是在细胞膜上吧！在对膜蛋白进行纯化和纯化的时候，要用去污剂将蛋白与细胞膜进行分离，并在去污剂溶解的状态下进行纯化，纯化后膜蛋除去白去污剂再进行重构。你用的triton应该不能（ ...

可以用ddm来溶解膜蛋白，你溶解的时候破碎了吗？
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3楼2013-05-23 17:25:33
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kikiwitch

新虫 (初入文坛)
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3楼: Originally posted by edoz1986 at 2013-05-23 17:25:33
可以用ddm来溶解膜蛋白，你溶解的时候破碎了吗？...

是的，我先超声将细胞破碎后，用ultracentrifugation方法将上清与膜分开，之后用
5% wt/vol Triton X-100, 50 mM Hepes pH 7.4, 200 mM NaCl 溶液进行溶解。
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4楼2013-05-23 17:38:42
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kikiwitch

新虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by edoz1986 at 2013-05-23 17:12:01
你的膜蛋白应该没有提取出来，还是在细胞膜上吧！在对膜蛋白进行纯化和纯化的时候，要用去污剂将蛋白与细胞膜进行分离，并在去污剂溶解的状态下进行纯化，纯化后膜蛋除去白去污剂再进行重构。你用的triton应该不能（ ...

但是我查的文献里有这么说的：
(DDM), Triton X-100 (TX-100) and Triton X-114 (TX-114) are commonly used for solubilization of membranes when keeping protein structure and function intact。。。
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5楼2013-05-23 17:44:51
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edoz1986

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5楼: Originally posted by kikiwitch at 2013-05-23 17:44:51
但是我查的文献里有这么说的：
(DDM), Triton X-100 (TX-100) and Triton X-114 (TX-114) are commonly used for solubilization of membranes when keeping protein structure and function intact。。。

:sh ...

去污剂的提取能力需要做小试取最佳
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6楼2013-05-23 20:08:18
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kikiwitch

新虫 (初入文坛)
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8楼: Originally posted by edoz1986 at 2013-05-23 22:04:11
用普通ｂｕｆｆｅｒ洗柱子就好了啊...

抱住大牛求详细描述。还有，什么叫小试取啊？本人是膜蛋白入门菜鸟，求指教。
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9楼2013-05-24 15:41:05
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edoz1986

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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-25 22:26:04
用去污剂把蛋白提取出来，然后挂在对应的 柱子上，然后用不含去污剂的buffer洗杂就是了啊
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lzjessie_wlf
10楼2013-05-24 15:45:33
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