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715097730

铜虫 (小有名气)

[求助] 求解:纯化蛋白跑SDS-PAGE,没有条带 已有1人参与

各位大神,小妹现在遇到一大难题。
我有一株野生菌产我要的酶,发酵后我对粗酶液进行了盐析和透析,然后过了强阴离子柱,再把洗脱的蛋白冻干后用tris复溶,浓度大约300微克/毫升。之后就想做一个SDS-PAGE看看蛋白纯不纯,还有它的分子量。
分离胶和浓缩胶分别是12%和5%,但是就是没有条带,可是Marker是有条带的。不知道是什么原因,跪求各位能够解答!!!!!!!
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
715097730: 金币+20, 有帮助 2013-10-11 15:46:00
引用回帖:
6楼: Originally posted by 715097730 at 2013-10-05 12:03:07
我是用60%-80%硫酸铵盐析的,透析后的样品是有酶活的,而且过完离子交换柱的样品也是有酶活的。不知道问题到底出在哪里,就是没有条带
...

如果做SDS-PAGE的样品有酶活,但是看不到蛋白条带,可能是样品不纯,上样量不够。还有可能是有其它蛋白或者杂质干扰酶活测定。
7楼2013-10-06 00:39:37
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普通回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+1, 鼓励应助! 2013-10-11 19:23:32
你通过什么方法检测你要的酶,测酶活吗?你可以分别监测纯化前的粗酶液、纯化过程中的各个组分的酶活,确定酶是否在纯化过程中丢失或者失活。
2楼2013-10-04 22:21:41
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lmqml24

禁虫 (小有名气)

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
715097730: 金币+10 2013-10-11 15:47:03
laozuzunzhe: 金币+2, 鼓励应助! 2013-10-11 19:23:42
本帖内容被屏蔽

3楼2013-10-04 23:49:43
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匿名

用户注销 (初入文坛)

感谢参与,应助指数 +1
本帖仅楼主可见
4楼2013-10-05 10:46:12
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715097730

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-10-04 22:21:41
你通过什么方法检测你要的酶,测酶活吗?你可以分别监测纯化前的粗酶液、纯化过程中的各个组分的酶活,确定酶是否在纯化过程中丢失或者失活。

每个过程都有测酶活的,蛋白不会完全丢失

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
5楼2013-10-05 11:56:03
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715097730

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by lmqml24 at 2013-10-04 23:49:43
纯化的每一步都应该用SDS-PAGE检测下的,这样既能判断纯化的效果,又能对目标条带进行跟踪。另外,透析时间较长,酶易失活。不知楼主是否对该酶的特性已知,盐析沉淀的浓度大的话,可以考虑疏水交换层析;浓度小的 ...

我是用60%-80%硫酸铵盐析的,透析后的样品是有酶活的,而且过完离子交换柱的样品也是有酶活的。不知道问题到底出在哪里,就是没有条带

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
6楼2013-10-05 12:03:07
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lmqml24

禁虫 (小有名气)

本帖内容被屏蔽

8楼2013-10-06 13:05:18
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felling_123

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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715097730: 金币+10 2013-10-11 15:46:19
建议增加样品的浓度(该样品浓度的5~10倍),因为你的样品“300ug/ml“不一定是实际浓度,某些蛋白浓度测定方法对低浓度蛋白测定误差大,低浓度的样品是看不见条带的。祝你好运
不进则退,时刻努力
9楼2013-10-06 15:26:31
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alarace

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
有可能蛋白的量比较低,所以看不得目的蛋白条带,可以用银染试试
10楼2013-10-06 16:11:39
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