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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白异源表达，条带大小不对啊
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宸登abc

银虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白异源表达，条带大小不对啊 已有1人参与

求高人指点，最近在做蛋白表达，枯草中的基因在大肠杆菌中表达。蛋白电泳明显有特异性条带，但是大小不对，差了将近10kD，测序也是正确的，而且表达出的蛋白是有酶活的。载体用的是pet30a，求指导！！！
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向学术狂人前进！！！
1楼 2013-10-13 16:59:55
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

wcfbio

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-10-14 08:26:59
宸登abc: 金币+2, ★有帮助 2013-10-14 09:29:13
这种情况我也遇到过，我也用大肠杆菌做蛋白表达是大肠杆菌BL21，也出现过这种情况，蛋白质电泳的结果一般只能做个大致的参考，有时候蛋白折叠，或者其他原因可能会导致蛋白分子量稍大一些，如何测序正确还有酶活的话，应该是没什么问题的。
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对于誓言一定要实现。
2楼2013-10-13 23:25:23
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-10-14 08:27:04
SDS-PAGEs上的表观分子量与理论不符的情况很多，是正常现象。如果测序正确也有酶活，蛋白应该是对的。可以继续往下实验。如果你不放心，可以过一个分子筛看看。
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3楼2013-10-14 00:11:00
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wcfbio

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-10-16 10:28:01
引用回帖:
5楼: Originally posted by 宸登abc at 2013-10-14 09:32:01
问题是我做的融合蛋白，在目的基因后面加了质粒上的his-tag，然后纯化不出来。补充一下，蛋白电泳上的特异性条带要比目的蛋白小，然后我就想是不是蛋白在大肠中被切割了后面一部分。...

这个你要分析好你连接载体的片段是否发生突变，突变会影响蛋白质的结果和折叠，加组氨酸标签一般都是用镍住纯化，你可以把条件摸索一下，NTA-0,NTA-20，NTA-60,80,100,300.500分别洗脱一下看看效果，据文献说，可能蛋白折叠的关系会把组氨酸标签折叠在里面，遇到这种情况估计要换载体试试，至于蛋白切割，我现在关注的比较少，确实有这种情况发生，一般会出现两条蛋白条带，你可以坐下非变性蛋白质电泳，和酶活力染色。
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对于誓言一定要实现。
8楼2013-10-14 10:43:30
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普通回帖

bolysu

禁虫 (著名写手)
★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-10-16 10:28:08
本帖内容被屏蔽
4楼2013-10-14 09:07:51
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宸登abc

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wcfbio at 2013-10-13 23:25:23
这种情况我也遇到过，我也用大肠杆菌做蛋白表达是大肠杆菌BL21，也出现过这种情况，蛋白质电泳的结果一般只能做个大致的参考，有时候蛋白折叠，或者其他原因可能会导致蛋白分子量稍大一些，如何测序正确还有酶活的话 ...

问题是我做的融合蛋白，在目的基因后面加了质粒上的his-tag，然后纯化不出来。补充一下，蛋白电泳上的特异性条带要比目的蛋白小，然后我就想是不是蛋白在大肠中被切割了后面一部分。
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向学术狂人前进！！！
5楼2013-10-14 09:32:01
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宸登abc

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by bolysu at 2013-10-14 09:07:51
如果你选的酶切位点不是ndel，本来就要大些，越靠后越大的，前面带了一大段tag的

我没说清楚，蛋白电泳的特异性条带比目的蛋白小的，我的蛋白后面也有his-tag的，但是纯化不出来
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向学术狂人前进！！！
6楼2013-10-14 09:33:16
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宸登abc

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-10-14 00:11:00
SDS-PAGEs上的表观分子量与理论不符的情况很多，是正常现象。如果测序正确也有酶活，蛋白应该是对的。可以继续往下实验。如果你不放心，可以过一个分子筛看看。

嗯，但是我觉得应该是蛋白后面的部分被切割了，因为his-tag在后面，但是我纯不出来，有没有这种情况？
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向学术狂人前进！！！
7楼2013-10-14 09:36:18
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 宸登abc at 2013-10-14 09:36:18
嗯，但是我觉得应该是蛋白后面的部分被切割了，因为his-tag在后面，但是我纯不出来，有没有这种情况？...

如果测序正确，一般不会有你说的情况。用his抗体做一下western，确定目标条带是否还带着tag。
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9楼2013-10-14 15:22:02
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小小技术官

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
宸登abc: 金币+3, ★有帮助 2013-10-16 10:15:18
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-10-16 10:28:17
纯化不出来，说明His没有表达，再加上比预期的要小。很有可能是表达截断了，这种情况一般是稀有密码子引起的。建议1，用Nde 下游的HIS 作为纯化标签 纯化。2，突变稀有密码子。
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生活是一面镜子，要笑着面对！
10楼2013-10-15 14:38:45
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