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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白异源表达，条带大小不对啊
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宸登abc

银虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白异源表达，条带大小不对啊 已有1人参与

求高人指点，最近在做蛋白表达，枯草中的基因在大肠杆菌中表达。蛋白电泳明显有特异性条带，但是大小不对，差了将近10kD，测序也是正确的，而且表达出的蛋白是有酶活的。载体用的是pet30a，求指导！！！
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向学术狂人前进！！！
1楼 2013-10-13 16:59:55
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wcfbio

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-10-16 10:28:01
引用回帖:
5楼: Originally posted by 宸登abc at 2013-10-14 09:32:01
问题是我做的融合蛋白，在目的基因后面加了质粒上的his-tag，然后纯化不出来。补充一下，蛋白电泳上的特异性条带要比目的蛋白小，然后我就想是不是蛋白在大肠中被切割了后面一部分。...

这个你要分析好你连接载体的片段是否发生突变，突变会影响蛋白质的结果和折叠，加组氨酸标签一般都是用镍住纯化，你可以把条件摸索一下，NTA-0,NTA-20，NTA-60,80,100,300.500分别洗脱一下看看效果，据文献说，可能蛋白折叠的关系会把组氨酸标签折叠在里面，遇到这种情况估计要换载体试试，至于蛋白切割，我现在关注的比较少，确实有这种情况发生，一般会出现两条蛋白条带，你可以坐下非变性蛋白质电泳，和酶活力染色。
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对于誓言一定要实现。
8楼2013-10-14 10:43:30
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wcfbio

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-10-14 08:26:59
宸登abc: 金币+2, ★有帮助 2013-10-14 09:29:13
这种情况我也遇到过，我也用大肠杆菌做蛋白表达是大肠杆菌BL21，也出现过这种情况，蛋白质电泳的结果一般只能做个大致的参考，有时候蛋白折叠，或者其他原因可能会导致蛋白分子量稍大一些，如何测序正确还有酶活的话，应该是没什么问题的。
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对于誓言一定要实现。
2楼2013-10-13 23:25:23
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-10-14 08:27:04
SDS-PAGEs上的表观分子量与理论不符的情况很多，是正常现象。如果测序正确也有酶活，蛋白应该是对的。可以继续往下实验。如果你不放心，可以过一个分子筛看看。
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3楼2013-10-14 00:11:00
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bolysu

禁虫 (著名写手)
★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-10-16 10:28:08
本帖内容被屏蔽
4楼2013-10-14 09:07:51
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