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宸登abc

银虫 (初入文坛)

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[求助] 蛋白异源表达，条带大小不对啊已有1人参与

求高人指点，最近在做蛋白表达，枯草中的基因在大肠杆菌中表达。蛋白电泳明显有特异性条带，但是大小不对，差了将近10kD，测序也是正确的，而且表达出的蛋白是有酶活的。载体用的是pet30a，求指导！！！

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向学术狂人前进！！！

1楼 2013-10-13 16:59:55

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wcfbio

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-10-16 10:28:01

引用回帖:

5楼: Originally posted by 宸登abc at 2013-10-14 09:32:01
问题是我做的融合蛋白，在目的基因后面加了质粒上的his-tag，然后纯化不出来。补充一下，蛋白电泳上的特异性条带要比目的蛋白小，然后我就想是不是蛋白在大肠中被切割了后面一部分。...

这个你要分析好你连接载体的片段是否发生突变，突变会影响蛋白质的结果和折叠，加组氨酸标签一般都是用镍住纯化，你可以把条件摸索一下，NTA-0,NTA-20，NTA-60,80,100,300.500分别洗脱一下看看效果，据文献说，可能蛋白折叠的关系会把组氨酸标签折叠在里面，遇到这种情况估计要换载体试试，至于蛋白切割，我现在关注的比较少，确实有这种情况发生，一般会出现两条蛋白条带，你可以坐下非变性蛋白质电泳，和酶活力染色。