应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助】新手求助！关于蛋白质异源表达纯化的问题
51/1返回列表
查看: 1128  |  回复: 4
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

firebread

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助】新手求助！关于蛋白质异源表达纯化的问题 已有2人参与

最近开始学习做蛋白质异源表达纯化，有一些问题想向大家请教：

1. 我用的是GE的GST纯化系统，把beads和细菌裂解液4℃过夜混合，把beads加上样缓冲液煮沸5 min，之后跑page胶发现有两条十分明亮的带，一条大小和纯GST Tag一致（27kDa），另一条和Tag+目的蛋白大小一致（40kDa）。按我理解，不应该有单独的GST吧。请问这样有人遇到过这种情况吗？

2. 我把上述beads用凝血酶4℃过夜酶切，离心后把上清和沉淀分别跑胶。沉淀中只有27kDa的带，而检测不到40kDa的带，说明目的蛋白应该是从Tag上切下来了，可是上清里没有预想中的13kDa条带。这有可能是因为蛋白质降解吗？

3. 我的上清里能够观察到很淡的Tag条带，洗脱的时候是不是也会洗下少量Tag？

谢谢大家！O(∩_∩)O
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-04-05 20:46:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kx444555

至尊木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2013-04-27 21:03:32
我以前纯化时遇到过这个现象，可能是TAG和目的蛋白之间断裂了，我觉得你可以把胶浓度调整一下，确定13KD没有跑出去，即然TAG和目的蛋白之间断裂的话，洗脱后会有TAG被洗下来也就不奇怪了，
赞一下 回复此楼
星陈代谢
2楼2013-04-05 21:36:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gaojuan1985

新虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流经验！ 2013-04-27 21:03:43
1. 肯定有单独的 GST带，只不过含量不确定。
2. 不推荐在胶上酶切，我们一般都是洗脱下来再酶切的。
赞一下 回复此楼
3楼2013-04-07 09:05:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

firebread

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kx444555 at 2013-04-05 21:36:09
我以前纯化时遇到过这个现象，可能是TAG和目的蛋白之间断裂了，我觉得你可以把胶浓度调整一下，确定13KD没有跑出去，即然TAG和目的蛋白之间断裂的话，洗脱后会有TAG被洗下来也就不奇怪了，

我的Marker最小带是10kDa，应该可以确认13kDa没有跑出去。Tag不是绑在beads上的吗？为什么断裂以后会被洗下来啊？
赞一下 回复此楼
4楼2013-04-07 10:08:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kx444555

至尊木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by firebread at 2013-04-07 10:08:43
我的Marker最小带是10kDa，应该可以确认13kDa没有跑出去。Tag不是绑在beads上的吗？为什么断裂以后会被洗下来啊？...

不可能亲和力达到完全绑住的程度，所以会有少数被洗脱下来
赞一下 回复此楼
星陈代谢
5楼2013-04-07 22:39:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 firebread 的主题更新
51/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 求材料调剂 +6 隔壁陈先生 2026-03-12 6/300 2026-03-18 15:35 by cmz0325
[考研] 296求调剂 +5 大口吃饭 身体健 2026-03-13 5/250 2026-03-17 21:05 by 不惑可乐
[考研] 308求调剂 +4 是Lupa啊 2026-03-16 4/200 2026-03-17 17:12 by ruiyingmiao
[考研] 一志愿苏州大学材料工程（085601）专硕有科研经历三项国奖两个实用型专利一项省级立项 +6 大火山小火山 2026-03-16 8/400 2026-03-17 15:05 by 无懈可击111
[考研] 11408 一志愿西电，277分求调剂 +3 zhouzhen654 2026-03-16 3/150 2026-03-17 07:03 by laoshidan
[考研] 化学调剂0703 +8 啊我我的 2026-03-11 8/400 2026-03-16 17:23 by 我的船我的海
[考研] 一志愿211 0703方向310分求调剂 +3 努力奋斗112 2026-03-15 3/150 2026-03-16 16:44 by houyaoxu
[考研] 中科院材料273求调剂 +4 yzydy 2026-03-15 4/200 2026-03-16 15:59 by Gaodh_82
[考研] 机械专硕调剂 +3 笨笨兔子 2026-03-12 3/150 2026-03-15 20:02 by 栗子粥?
[考研] 材料与化工 323 英一+数二+物化，一志愿：哈工大 本人本科双一流 +4 自由的_飞翔 2026-03-13 5/250 2026-03-14 19:39 by hmn_wj
[考研] 297一志愿上交085600求调剂 +5 指尖八千里 2026-03-14 5/250 2026-03-14 17:26 by a不易
[考研] 328求调剂 +3 5201314Lsy！ 2026-03-13 6/300 2026-03-14 15:31 by hyswxzs
[考研] 297求调剂 +4 学海漂泊 2026-03-13 4/200 2026-03-14 11:51 by 热情沙漠
[考研] 308 085701 四六级已过求调剂 +7 温乔乔乔乔 2026-03-12 14/700 2026-03-14 10:49 by JourneyLucky
[考研] 材料与化工（0856）304求B区调剂 +6 邱gl 2026-03-12 7/350 2026-03-13 23:24 by 邱gl
[考研] 304求调剂 +6 Mochaaaa 2026-03-12 7/350 2026-03-13 22:18 by 星空星月
[考研] 311求调剂 +3 冬十三 2026-03-13 3/150 2026-03-13 20:41 by JourneyLucky
[考研] 0703化学求调剂 +7 绿豆芹菜汤 2026-03-12 7/350 2026-03-13 17:25 by njzyff
[考研] 求调剂 +7 18880831720 2026-03-11 7/350 2026-03-13 16:10 by JourneyLucky
[考研] 一志愿211化学学硕310分求调剂 +8 努力奋斗112 2026-03-12 9/450 2026-03-13 15:41 by JourneyLucky
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭