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adslye

银虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】关于基因组纯化的问题:异丙醇法已有3人参与

英文原文:
1.   Adjust  the  salt  concentration  if  necessary,  for  example,  with  sodium  acetate  (0.3  M,  pH  5.2,  final
concentration) or ammonium acetate (2.0–2.5 M, final concentration).
2.   Add 0.6–0.7 volumes of room-temperature isopropanol to the DNA solution and mix well.
这两步我的操作是:
在0.3  M,  pH  5.2的醋酸钠中加入20ul我的基因组DNA。然后再加入700ul的异丙醇。
然而之后的4'c ,20min离心并没有沉淀。

我想问是不是我理解错了,那个0.3M是包括异丙醇的。

还有基因组纯化用:苯酚,氯仿依次萃取再用醇提的。

请问对于基因组的纯化,两种方法哪种合适?

谢谢!!
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adslye

银虫 (正式写手)

帮个忙。。。。各位。。。。
2楼2010-08-07 21:07:15
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ben1147

木虫 (正式写手)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
lmzxcom1(金币+1):谢谢积极交流 2010-08-07 22:23:46
一般是这么操作的
配制3M NaAc(pH 5.2)
向DNA溶液中加入1/10体积的上述NaAc溶液(比如100uLDNA,就加10uL,这样终浓度就近似是0.3M)
然后加入70uL室温异丙醇(0.7倍体积)混匀,静置沉淀

一般来说,如果样品里有蛋白杂质,就要用酚/氯仿,氯仿依次抽提之后再用醇沉淀
醇沉淀的时候可以加入NaAc,低温静置,有利于核酸沉淀
3楼2010-08-07 21:31:59
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adslye

银虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by ben1147 at 2010-08-07 21:31:59:
一般是这么操作的
配制3M NaAc(pH 5.2)
向DNA溶液中加入1/10体积的上述NaAc溶液(比如100uLDNA,就加10uL,这样终浓度就近似是0.3M)
然后加入70uL室温异丙醇(0.7倍体积)混匀,静置沉淀

一般来说,如果 ...

那异丙醇法除蛋白效果好不?
4楼2010-08-07 22:14:03
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

异丙醇是有机溶剂,但不是所有有机溶剂都能使蛋白质变性,在我的实验里,异丙醇沉淀后的蛋白质会有40-50%能重新溶解在水里。

这两句话说的是保持溶液里.3  M,  pH  5.2,  final concentration,是最终浓度和pH值。然后加入溶液体积 0.6–0.7 volumes 倍的异丙醇,比如溶液体积是1毫升,异丙醇就加进去600-700微升,总体积大概1.6-1.7毫升。
流星来时我许了个愿,愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具,久不看论坛一来就提问者,宁弃EPI和VIP也不回帖。
5楼2010-08-08 03:21:04
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ben1147

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by adslye at 2010-08-07 22:14:03:


那异丙醇法除蛋白效果好不?

醇在这里的作用主要是沉淀核酸

要除蛋白还是推荐酚/氯仿,氯仿抽提
6楼2010-08-08 10:56:16
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adslye

银虫 (正式写手)

哦,知道了,多谢!
7楼2010-08-08 11:04:53
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