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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于DNA提取的问题。请高手赐教
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ffrc

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于DNA提取的问题。请高手赐教已有9人参与

请高手赐教以下问题。
我提DNA过程中，先后用裂解液、饱和酚、酚仿醇（25:24:1）、氯仿、酒精、75%酒精。最后用TE溶解。
此过程没有用RNase。
这个过程提取下来的DNA有RNA干扰，有蛋白残留。
请问如何将这个粗提的DNA纯化。
在哪里加RNase,加多少，如何一步步纯化。
请细告知。谢谢
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1楼2010-08-04 21:45:11
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louli

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★
ffrc(金币+1):谢谢参与
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-08-05 06:05:32
引用回帖:
Originally posted by ffrc at 2010-08-04 21:45:11:
请高手赐教以下问题。
我提DNA过程中，先后用裂解液、饱和酚、酚仿醇（25:24:1）、氯仿、酒精、75%酒精。最后用TE溶解。
此过程没有用RNase。
这个过程提取下来的DNA有RNA干扰，有蛋白残留。
请问如何将这个粗 ...

加完裂解液之后，水浴65°一个小时，降至室温，加入5微升的RNAse，如果蛋白含量高，加饱和酚抽提，然后加入等体积的氯仿异戊醇（24：1），离心，取上清，加十分之一体积的乙酸钠和等体积的异丙醇，离心10min。用76%的乙醇离心5min洗涤，再用70%的乙醇洗涤，晾干，一般用水溶解。
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2楼2010-08-04 22:25:00
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hustxiong

木虫 (正式写手)
★
ffrc(金币+1):谢谢参与
要看看 你用的是什么裂解液了，CTAB,SDS 等都是PCR抑制剂，彻底清除需要相应试剂的剂量把握，比如用醋酸钾除SDS。
建议  购买DNA纯化试剂盒，这样后续试验会顺利很多，国产的 一般不会太贵，效果都还不错。原理就是通过硅胶柱吸附后， 再洗脱。
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3楼2010-08-04 22:38:43
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accident1256

铜虫 (小有名气)
★
ffrc(金币+1):谢谢参与
看试剂盒的说明书~~
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人各有命~
4楼2010-08-04 22:45:21
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xingzhb

木虫 (著名写手)
★
ffrc(金币+1):谢谢参与
帮顶····
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为生活所迫而科研
5楼2010-08-04 23:14:20
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dorecnu

木虫 (正式写手)

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★
ffrc(金币+1):谢谢参与
RNA酶一般在裂解完成之后就加入，37摄氏度处理30分钟即可。有蛋白残留的话，多用酚氯仿抽提几次即可，另外，沉淀之前要加入3M的醋酸钠。
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6楼2010-08-04 23:59:11
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匿名

用户注销 (正式写手)
★
ffrc(金币+1):谢谢参与
本帖仅楼主可见
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7楼2010-08-05 00:00:55
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nql_sdau

银虫 (小有名气)
★
ffrc(金币+1):谢谢参与
我当时提取的是昆虫的！动物蛋白特别的多，我加了蛋白酶K降解蛋白。你试试看！
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8楼2010-08-05 08:44:51
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rosalie161

金虫 (正式写手)

提取详细

★
ffrc(金币+1):谢谢参与
ffrc(金币+10):非常详细。巨谢 2010-08-05 10:11:49
（2）        将100ml培养液转移至离心管中，12000rpm离心5min，弃上清。
（3）        加入9.5mlTE悬浮沉淀，并加0.5ml10%SDS，50μl20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶K。混匀37℃保温1小时。
（4）        加1.5ml5mol/LNaCl，混匀。
（5）        加1.5mCTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20分钟。
（6）        用等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提，12000rpm离心10分钟，将上清液移至干净离心管。
（7）        用等体积异戊醇：氯仿（1：24）抽提，12000rmp离心10分钟，取上清液移至干净管中。
（8）        加入0.6-1倍体积异丙醇，-20℃静置30min.
（9）        12000rpm离心10min弃上清。
（10）将沉淀悬浮于10ml超纯水中。
（11）加入RNase,37℃水浴30min.
（12）加入等体积饱和酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），上下颠倒数次混匀。
（13）12000rpm离心10min,吸取上相液体。
（14）加入等体积饱和氯仿/异戊醇（24：1），上下颠倒数次混匀。
（15）12000rpm离心10min,吸取上相液体。
（16）加入1/10体积3M NaAc，在加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20℃放置30min.
（17）12000rpm离心15min,弃上清，用70%的乙醇洗涤沉淀。
（18）自然风干后，加入1-2mlTE或者超纯水溶解DNA。
（19）紫外分光光度计测定OD235,OD260和OD280，以判定提取的基因组DNA的纯度和浓度。
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Rosalei.....
9楼2010-08-05 09:12:37
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xp198766

铁杆木虫 (著名写手)

小木虫职业打酱油滴~~！
★
ffrc(金币+1):谢谢参与
ffrc(金币+5):有道理 2010-08-05 12:55:27
请问LZ是提什么的DNA？好像蛋白的话，可以用酚仿多纯化几次，就是说  加入等体积饱和酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），上下颠倒数次混匀。   这一步多几次，可以得到比较清的DNA上清液，再用酒精等纯化……RNA不是很容易降解吗？还有，我们自然风干后，一般用水溶解，不用TE，TE好像对PCR有影响……
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10楼2010-08-05 11:38:30
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