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ffrc

金虫 (小有名气)

应助: 0 (幼儿园)
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在线: 204小时
虫号: 595800
注册: 2008-09-08
专业: 环境污染化学

[交流] 【求助/交流】关于DNA提取的问题。请高手赐教已有9人参与

请高手赐教以下问题。
我提DNA过程中，先后用裂解液、饱和酚、酚仿醇（25:24:1）、氯仿、酒精、75%酒精。最后用TE溶解。
此过程没有用RNase。
这个过程提取下来的DNA有RNA干扰，有蛋白残留。
请问如何将这个粗提的DNA纯化。
在哪里加RNase,加多少，如何一步步纯化。
请细告知。谢谢

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1楼2010-08-04 21:45:11

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rosalie161

金虫 (正式写手)

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在线: 53.6小时
虫号: 482150
注册: 2007-12-20
性别: GG
专业: 植物化学保护

提取详细

★
ffrc(金币+1):谢谢参与
ffrc(金币+10):非常详细。巨谢 2010-08-05 10:11:49

（2）将100ml培养液转移至离心管中，12000rpm离心5min，弃上清。
（3）加入9.5mlTE悬浮沉淀，并加0.5ml10%SDS，50μl20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶K。混匀37℃保温1小时。
（4）加1.5ml5mol/LNaCl，混匀。
（5）加1.5mCTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20分钟。
（6）用等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提，12000rpm离心10分钟，将上清液移至干净离心管。
（7）用等体积异戊醇：氯仿（1：24）抽提，12000rmp离心10分钟，取上清液移至干净管中。
（8）加入0.6-1倍体积异丙醇，-20℃静置30min.
（9） 12000rpm离心10min弃上清。
（10）将沉淀悬浮于10ml超纯水中。
（11）加入RNase,37℃水浴30min.
（12）加入等体积饱和酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），上下颠倒数次混匀。
（13）12000rpm离心10min,吸取上相液体。
（14）加入等体积饱和氯仿/异戊醇（24：1），上下颠倒数次混匀。
（15）12000rpm离心10min,吸取上相液体。
（16）加入1/10体积3M NaAc，在加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20℃放置30min.
（17）12000rpm离心15min,弃上清，用70%的乙醇洗涤沉淀。
（18）自然风干后，加入1-2mlTE或者超纯水溶解DNA。
（19）紫外分光光度计测定OD235,OD260和OD280，以判定提取的基因组DNA的纯度和浓度。

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Rosalei.....

9楼2010-08-05 09:12:37

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louli

铜虫 (小有名气)

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专业: 生物化学

★ ★ ★
ffrc(金币+1):谢谢参与
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-08-05 06:05:32

引用回帖:

Originally posted by ffrc at 2010-08-04 21:45:11:
请高手赐教以下问题。
我提DNA过程中，先后用裂解液、饱和酚、酚仿醇（25:24:1）、氯仿、酒精、75%酒精。最后用TE溶解。
此过程没有用RNase。
这个过程提取下来的DNA有RNA干扰，有蛋白残留。
请问如何将这个粗 ...

加完裂解液之后，水浴65°一个小时，降至室温，加入5微升的RNAse，如果蛋白含量高，加饱和酚抽提，然后加入等体积的氯仿异戊醇（24：1），离心，取上清，加十分之一体积的乙酸钠和等体积的异丙醇，离心10min。用76%的乙醇离心5min洗涤，再用70%的乙醇洗涤，晾干，一般用水溶解。

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2楼2010-08-04 22:25:00

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