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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助】新手求助！关于蛋白质异源表达纯化的问题
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firebread

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助】新手求助！关于蛋白质异源表达纯化的问题 已有2人参与

最近开始学习做蛋白质异源表达纯化，有一些问题想向大家请教：

1. 我用的是GE的GST纯化系统，把beads和细菌裂解液4℃过夜混合，把beads加上样缓冲液煮沸5 min，之后跑page胶发现有两条十分明亮的带，一条大小和纯GST Tag一致（27kDa），另一条和Tag+目的蛋白大小一致（40kDa）。按我理解，不应该有单独的GST吧。请问这样有人遇到过这种情况吗？

2. 我把上述beads用凝血酶4℃过夜酶切，离心后把上清和沉淀分别跑胶。沉淀中只有27kDa的带，而检测不到40kDa的带，说明目的蛋白应该是从Tag上切下来了，可是上清里没有预想中的13kDa条带。这有可能是因为蛋白质降解吗？

3. 我的上清里能够观察到很淡的Tag条带，洗脱的时候是不是也会洗下少量Tag？

谢谢大家！O(∩_∩)O
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1楼 2013-04-05 20:46:35
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firebread

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kx444555 at 2013-04-05 21:36:09
我以前纯化时遇到过这个现象，可能是TAG和目的蛋白之间断裂了，我觉得你可以把胶浓度调整一下，确定13KD没有跑出去，即然TAG和目的蛋白之间断裂的话，洗脱后会有TAG被洗下来也就不奇怪了，

我的Marker最小带是10kDa，应该可以确认13kDa没有跑出去。Tag不是绑在beads上的吗？为什么断裂以后会被洗下来啊？
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4楼2013-04-07 10:08:43
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kx444555

至尊木虫 (正式写手)
★ ★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2013-04-27 21:03:32
我以前纯化时遇到过这个现象，可能是TAG和目的蛋白之间断裂了，我觉得你可以把胶浓度调整一下，确定13KD没有跑出去，即然TAG和目的蛋白之间断裂的话，洗脱后会有TAG被洗下来也就不奇怪了，
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星陈代谢
2楼2013-04-05 21:36:09
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gaojuan1985

新虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流经验！ 2013-04-27 21:03:43
1. 肯定有单独的 GST带，只不过含量不确定。
2. 不推荐在胶上酶切，我们一般都是洗脱下来再酶切的。
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3楼2013-04-07 09:05:04
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kx444555

至尊木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by firebread at 2013-04-07 10:08:43
我的Marker最小带是10kDa，应该可以确认13kDa没有跑出去。Tag不是绑在beads上的吗？为什么断裂以后会被洗下来啊？...

不可能亲和力达到完全绑住的程度，所以会有少数被洗脱下来
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星陈代谢
5楼2013-04-07 22:39:32
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