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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】P不出正确条带
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asdfghjkl-00

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】P不出正确条带

我设计的引物是900的，但是在750出来了一个，500出来了一个，我P 了好几次，否没有得到正确条带，请问是怎么回事啊？是反映条件的问题还是引物问题？如果是反映条件的问题，该如何改进？如果是引物的问题，有没有什么办法可以验证引物的正确性啊？
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1楼 2011-01-08 11:13:50
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天使托

专家顾问 (职业作家)
★
dhd997(金币+1):鼓励交流 2011-01-08 14:49:41
你的问题的确很多，可以看看版内的引物设计专题，另外看看自己的引物设计的是否合适；再看看反应的体系，可以改变反应体系！
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2楼2011-01-08 14:45:10
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pxhcooh

金虫 (正式写手)
★
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asdfghjkl-00(金币+1): 2011-01-09 09:21:46
你把你的引物设计信息给大家看看 或许会有答案
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3楼2011-01-08 14:49:09
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zx1984

木虫 (正式写手)
★
rainwander(金币+1):鼓励积极参与~~~ 2011-01-08 16:02:52
引物、模板、时间、温度，好好查查
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4楼2011-01-08 15:18:06
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qujinyan123

金虫 (初入文坛)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+2):good 2011-01-08 17:09:23
出现非特异性条带，首先要考虑的是引物的问题，引物设计是不是合理。是否进行了同源性检查。
   第二，就是反应体系的问题，各组分的浓度问题，比如如果dNTP加入太多，也会引起非特异性条带，你可以重新优化一下反应体系。
   第三，就是退火温度，可以多做几个梯度温度试一下。
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5楼2011-01-08 16:51:32
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asdfghjkl-00

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by pxhcooh at 2011-01-08 14:49:09:
你把你的引物设计信息给大家看看 或许会有答案

引物是辅酶M甲基转移酶mtaA
序列为：上游：GARGGTAARCCTGTNGAY
            下游：AGKACRTCKATKCCKCCYTC
长度应该是900bp
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6楼2011-01-09 09:18:35
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asdfghjkl-00

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by qujinyan123 at 2011-01-08 16:51:32:
出现非特异性条带，首先要考虑的是引物的问题，引物设计是不是合理。是否进行了同源性检查。
   第二，就是反应体系的问题，各组分的浓度问题，比如如果dNTP加入太多，也会引起非特异性条带，你可以重新优化一下 ...

我的引物序列是从文献上看的，我想知道如何判断它是否合理。请教一下，该怎么进行同源性检查？谢谢！
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7楼2011-01-09 09:20:42
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pxhcooh

金虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
Originally posted by asdfghjkl-00 at 2011-01-09 09:18:35:

引物是辅酶M甲基转移酶mtaA
序列为：上游：GARGGTAARCCTGTNGAY
            下游：AGKACRTCKATKCCKCCYTC
长度应该是900bp

你怎么不自己设计啊  不自己设计怎么知道引物条件和二聚体啊 建议问问自己实验同行设计一下 很简单的
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8楼2011-01-09 11:41:10
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real339

金虫 (正式写手)
★ ★
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1949stone(金币+1):有的的确是 2011-01-09 20:25:20
非特异结合的可能比较大。还有就是你的染色剂是EB吗？目前有的替代品很差的，能使条带位置差上个100-200bp。
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9楼2011-01-09 11:52:26
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asdfghjkl-00

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by real339 at 2011-01-09 11:52:26:
非特异结合的可能比较大。还有就是你的染色剂是EB吗？目前有的替代品很差的，能使条带位置差上个100-200bp。

我用的是GOLDVIEW，做其他引物的时候条带还是差不多的，这个引物是新合成的，所以怀疑是引物的问题，但是又不知道该怎么验证引物的正确性
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10楼2011-01-09 13:12:14
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real339

金虫 (正式写手)
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引用回帖:
Originally posted by real339 at 2011-01-09 11:52:26:
非特异结合的可能比较大。还有就是你的染色剂是EB吗？目前有的替代品很差的，能使条带位置差上个100-200bp。

多设计几对引物试试吧，实在不行就把你的片段测序，分析一下片段是不是你想要的基因或目的片段的一部分
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11楼2011-01-09 15:05:09
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shourjruo

铜虫 (小有名气)
★
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Originally posted by real339 at 2011-01-09 11:52:26:
非特异结合的可能比较大。还有就是你的染色剂是EB吗？目前有的替代品很差的，能使条带位置差上个100-200bp。

经常感觉条带大小不对，原来是染料的问题。
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12楼2011-01-09 15:31:42
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haitian0625

金虫 (小有名气)
★
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Originally posted by asdfghjkl-00 at 2011-01-09 09:20:42:

我的引物序列是从文献上看的，我想知道如何判断它是否合理。请教一下，该怎么进行同源性检查？谢谢！

同源性检查就是可以将你的引物序列放入BLAST网站，比对一下；
产物900，那是不是你的延伸温度和时间，高了、短了？
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13楼2011-01-09 15:41:27
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green1223

木虫 (职业作家)
★
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Originally posted by shourjruo at 2011-01-09 15:31:42:


经常感觉条带大小不对，原来是染料的问题。

燃料还会影响条带吗  ？  不太懂呀  学习了
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14楼2011-01-09 15:48:29
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real339

金虫 (正式写手)
★
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亲身经历过啊，后来同样的产物换EB，一次就OK了。
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15楼2011-01-09 18:19:39
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yabing0324

金虫 (职业作家)
感觉是引物的问题
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16楼2011-01-09 19:51:49
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qujinyan123

金虫 (初入文坛)
★
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我的引物序列是从文献上看的，我想知道如何判断它是否合理。请教一下，该怎么进行同源性检查？谢谢！
   你可以先从美国NCBI网站去查找一下原始序列，看相关原始序列能否找到，是否正确，我曾碰到这样的情况，从一篇文献中的序列按相关原则反向推出的序列比对原始序列，中间少一个碱基，其余各项情况符合，这个肯定无法PCR出来，问过老师，为什么会出现这种情况，老师说，有些人为保护所谓的隐私权之类的，会故意更改或增减相关碱基，导致按照文献根本无法做出来。所以按照文献操作要慎重，最好自己设计。我课题的几个引物全是自己设计的，比我从文献上找的，效果都要好。
    同源性检查也是在NCBI网站中去做，讲起来比较麻烦，你可以咨询分子生物学相关专业的师兄、师姐或老师，让他们具体教一下你。
   设计引物主要涉及到引物长度，产物长度，退火温度，是否会形成发卡结、二聚体之类的。
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17楼2011-01-10 08:32:03
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qujinyan123

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by asdfghjkl-00 at 2011-01-09 09:20:42:

我的引物序列是从文献上看的，我想知道如何判断它是否合理。请教一下，该怎么进行同源性检查？谢谢！

你可以先从美国NCBI网站去查找一下原始序列，看相关原始序列能否找到，是否正确，我曾碰到这样的情况，从一篇文献中的序列按相关原则反向推出的序列比对原始序列，中间少一个碱基，其余各项情况符合，这个肯定无法PCR出来，问过老师，为什么会出现这种情况，老师说，有些人为保护所谓的隐私权之类的，会故意更改或增减相关碱基，导致按照文献根本无法做出来。所以按照文献操作要慎重，最好自己设计。我课题的几个引物全是自己设计的，比我从文献上找的，效果都要好。
    同源性检查也是在NCBI网站中去做，讲起来比较麻烦，你可以咨询分子生物学相关专业的师兄、师姐或老师，让他们具体教一下你。
   设计引物主要涉及到引物长度，产物长度，退火温度，是否会形成发卡结、二聚体之类的。
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18楼2011-01-10 08:33:44
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asdfghjkl-00

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by qujinyan123 at 2011-01-10 08:32:03:
我的引物序列是从文献上看的，我想知道如何判断它是否合理。请教一下，该怎么进行同源性检查？谢谢！
   你可以先从美国NCBI网站去查找一下原始序列，看相关原始序列能否找到，是否正确，我曾碰到这样的情况，从 ...

好的，非常感谢！
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19楼2011-01-10 10:52:14
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