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asdfghjkl-00

新虫 (初入文坛)

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[交流] 【求助/交流】P不出正确条带

我设计的引物是900的，但是在750出来了一个，500出来了一个，我P 了好几次，否没有得到正确条带，请问是怎么回事啊？是反映条件的问题还是引物问题？如果是反映条件的问题，该如何改进？如果是引物的问题，有没有什么办法可以验证引物的正确性啊？

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1楼 2011-01-08 11:13:50

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qujinyan123

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引用回帖:

Originally posted by asdfghjkl-00 at 2011-01-09 09:20:42:

我的引物序列是从文献上看的，我想知道如何判断它是否合理。请教一下，该怎么进行同源性检查？谢谢！

你可以先从美国NCBI网站去查找一下原始序列，看相关原始序列能否找到，是否正确，我曾碰到这样的情况，从一篇文献中的序列按相关原则反向推出的序列比对原始序列，中间少一个碱基，其余各项情况符合，这个肯定无法PCR出来，问过老师，为什么会出现这种情况，老师说，有些人为保护所谓的隐私权之类的，会故意更改或增减相关碱基，导致按照文献根本无法做出来。所以按照文献操作要慎重，最好自己设计。我课题的几个引物全是自己设计的，比我从文献上找的，效果都要好。
同源性检查也是在NCBI网站中去做，讲起来比较麻烦，你可以咨询分子生物学相关专业的师兄、师姐或老师，让他们具体教一下你。
设计引物主要涉及到引物长度，产物长度，退火温度，是否会形成发卡结、二聚体之类的。