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宸登abc

银虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白异源表达,条带大小不对啊 已有1人参与

求高人指点,最近在做蛋白表达,枯草中的基因在大肠杆菌中表达。蛋白电泳明显有特异性条带,但是大小不对,差了将近10kD,测序也是正确的,而且表达出的蛋白是有酶活的。载体用的是pet30a,求指导!!!
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小小技术官

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
宸登abc: 金币+3, ★有帮助 2013-10-16 10:15:18
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-10-16 10:28:17
纯化不出来,说明His没有表达,再加上比预期的要小。很有可能是表达截断了,这种情况一般是稀有密码子引起的。建议1,用Nde 下游的HIS 作为纯化标签 纯化。2,突变稀有密码子。
生活是一面镜子,要笑着面对!
10楼2013-10-15 14:38:45
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wcfbio

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-10-14 08:26:59
宸登abc: 金币+2, ★有帮助 2013-10-14 09:29:13
这种情况我也遇到过,我也用大肠杆菌做蛋白表达是大肠杆菌BL21,也出现过这种情况,蛋白质电泳的结果一般只能做个大致的参考,有时候蛋白折叠,或者其他原因可能会导致蛋白分子量稍大一些,如何测序正确还有酶活的话,应该是没什么问题的。
对于誓言一定要实现。
2楼2013-10-13 23:25:23
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-10-14 08:27:04
SDS-PAGEs上的表观分子量与理论不符的情况很多,是正常现象。如果测序正确也有酶活,蛋白应该是对的。可以继续往下实验。如果你不放心,可以过一个分子筛看看。
3楼2013-10-14 00:11:00
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bolysu

禁虫 (著名写手)

★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-10-16 10:28:08
本帖内容被屏蔽

4楼2013-10-14 09:07:51
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