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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 重组大肠杆菌表达蛋白可溶，但无活性
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蛋白质生物学实验经验 核酸生物学实验经验 蛋白表达纯化与检测 蛋白表达纯化鉴定精华

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1楼 2014-08-20 15:45:50
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

凌波丽

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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-08-21 17:59:59
蛋白质的四聚体的形成不一定非要形成二硫键！有些蛋白质的四聚体就是靠非共价的次级键结合到一起的，最明显的是血红蛋白！2楼居然说四聚体形成一般是形成了二硫键是没有道理的！不知道阁下的生物化学课是不是及格了！？

有些蛋白质的多聚体，实际上是多个亚基就是靠非共价的次级键结合到一起的，有新的活性，比如G蛋白，有些蛋白质则是多个亚基组成完整的蛋白质才有生物活性，比如：核糖体。

蛋白质形成多聚体或者多个亚基装配成为完整的蛋白质，不是任何时候都是必然的过程，首先各个亚基自身序列和折叠状态都要正确，其次有一定的浓度要求和环境的离子强度要求和pH等要求。比如在体外装配核糖体和解离核糖体大小亚基时对镁离子浓度的不同的要求。

如果每个亚基的序列和折叠状态没有错误的话，要正常装配，一般可以参考该种蛋白质的最适合的生理条件和最大活性的条件进行配置缓冲溶液。对于不是膜蛋白的情况，一般蛋白质聚合和亚基装配成蛋白质，可以适当提高溶液的离子强度（可以分梯度），并且去除掉溶液中的表面活性剂和变性剂。对于膜蛋白质的装配则要要加入适当类型和浓度的脂类或者类似作用的温和的表面活性剂。
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10楼2014-08-21 12:39:46
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bio_sci

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【答案】应助回帖

★
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pingweihh(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-20 16:54:59
碰到过类似情况，一般四级结构是会自发形成的，也就是说亚基表达出来后，会自动聚合在一起。这种四级结构有时候，SDS-PAGE也不一定能够将其打开。
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3楼2014-08-20 16:01:56
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2014-08-21 18:00:25
你就按照2楼的说法去做，再加点催化二硫键形成的催化剂！告诉你：二硫键在空气中会自动形成，有氧气反应，即使真的形成了肽链之间的二硫键，也只要使得不同亚基正常的聚合到一起，就会形成正确的二硫键。

还有，一般对于可溶性的球状蛋白质而言，无论是蛋白质分子之间还是不同亚基之间的相互作用一般都是都是非共价的相互作用！
为什么？
1.为了便于聚合和解离，这是一种重要的生物功能的调节方式！也为了遗传上和进化上的安全性，因为每个亚基的编码单位更小，表达出出来出错的可能性更低。绝大多别构酶和别构蛋白质都是多亚基，没有在亚基之间形成任何共价键。
2.非共价聚合时有一个亚基坏了，其他的还能够起作用，不至于蛋白质整个失去功能，更重要的是如果一个亚基坏了，下次装配时坏的亚基就可能不再被识别和装配了！如果多个亚基凑在一起就一般地形成了二硫键哪？！一荣俱荣一损俱损！
3.在不同的生理条件下形成动态的装配过程，灵活的实现生理功能，比如微管，血红蛋白，PKA。
4.细胞转运定位方便，先把各个小单位蛋白质运送过去在装配起来，比整个形成了二硫键的蛋白质一起运过去要方便吧，况且有不少时候可能还要运输多次，比如：在核膜解体和重建时的各种核内蛋白质的跨核膜运输。
等等。
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12楼2014-08-21 12:56:00
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jpfwx

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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pingweihh(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-08-20 16:54:39
pingweihh: 金币+12, 5 2014-08-21 09:03:45
首先可以确定一点，相同单体构成的四聚体是因为产生了高级结构，一般是二硫键的形成，这样才会有生物活性。
不知道你的四聚体的高级结构是怎么样的。但是大肠杆菌表达的蛋白是不能自己进行后修饰的，也就是说不会将单体正确的组装成有活性的四聚体。你电泳跑出来的蛋白是不是单体的位置？
如果确定单体是正确的可溶表达，你可以试试进行体外复性，看看能不能形成有活性的四聚体。
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年轻，拼搏
2楼2014-08-20 15:57:46
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匿名

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4楼2014-08-20 21:45:02
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5楼2014-08-20 21:46:52
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6楼2014-08-20 21:50:00
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jpfwx

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by pingweihh at 2014-08-20 21:45:02
那是不是大肠杆菌就不能表达同一单体的多聚体蛋白呢？我的目的蛋白在跑SDS-PAGE时，目的条带是在单体位置。带标签的也能体外复性形成四聚体吗？...

可以复性。不过用大肠杆菌做具有高级结构的蛋白是有些难度。但是也是可以做的，如果菌株鉴定正确可以试一下诱导条件，低温、低浓度IPTG、长时间诱导等。以前我做过周质表达，不多量非常少。
你SDS是还原还是非还原？如果非还原也看不到四聚体条带的话那就是没有。
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年轻，拼搏
7楼2014-08-21 09:09:39
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8楼2014-08-21 11:03:51
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金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by pingweihh at 2014-08-21 11:03:51
做的是变性凝胶电泳，想试一下native-page看一下有没有四聚体。这个用大肠杆菌表达难不难？因为基因来源是醋酸杆菌，都是原核生物，也很难表达出带活性的四聚体吗？...

这个倒是没研究过，不过如果是杆菌来源的话理论上应该可以。你先试一下非还原电泳看一下吧。还有这个蛋白的高级结构到底是什么样的？有没有比较敏感的酶？
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年轻，拼搏
9楼2014-08-21 11:41:42
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