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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 重组大肠杆菌表达蛋白可溶，但无活性
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1楼 2014-08-20 15:45:50
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jpfwx

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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pingweihh(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-08-20 16:54:39
pingweihh: 金币+12, 5 2014-08-21 09:03:45
首先可以确定一点，相同单体构成的四聚体是因为产生了高级结构，一般是二硫键的形成，这样才会有生物活性。
不知道你的四聚体的高级结构是怎么样的。但是大肠杆菌表达的蛋白是不能自己进行后修饰的，也就是说不会将单体正确的组装成有活性的四聚体。你电泳跑出来的蛋白是不是单体的位置？
如果确定单体是正确的可溶表达，你可以试试进行体外复性，看看能不能形成有活性的四聚体。
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年轻，拼搏
2楼2014-08-20 15:57:46
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jpfwx

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by pingweihh at 2014-08-20 21:45:02
那是不是大肠杆菌就不能表达同一单体的多聚体蛋白呢？我的目的蛋白在跑SDS-PAGE时，目的条带是在单体位置。带标签的也能体外复性形成四聚体吗？...

可以复性。不过用大肠杆菌做具有高级结构的蛋白是有些难度。但是也是可以做的，如果菌株鉴定正确可以试一下诱导条件，低温、低浓度IPTG、长时间诱导等。以前我做过周质表达，不多量非常少。
你SDS是还原还是非还原？如果非还原也看不到四聚体条带的话那就是没有。
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年轻，拼搏
7楼2014-08-21 09:09:39
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jpfwx

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by pingweihh at 2014-08-21 11:03:51
做的是变性凝胶电泳，想试一下native-page看一下有没有四聚体。这个用大肠杆菌表达难不难？因为基因来源是醋酸杆菌，都是原核生物，也很难表达出带活性的四聚体吗？...

这个倒是没研究过，不过如果是杆菌来源的话理论上应该可以。你先试一下非还原电泳看一下吧。还有这个蛋白的高级结构到底是什么样的？有没有比较敏感的酶？
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年轻，拼搏
9楼2014-08-21 11:41:42
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jpfwx

金虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 凌波丽 at 2014-08-21 12:39:46
蛋白质的四聚体的形成不一定非要形成二硫键！有些蛋白质的四聚体就是靠非共价的次级键结合到一起的，最明显的是血红蛋白！2楼居然说四聚体形成一般是形成了二硫键是没有道理的！不知道阁下的生物化学课是不是及格了 ...

14楼2014-08-21 16:31:40
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