应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 同时表达两种蛋白表达问题
41/1返回列表
查看: 3016  |  回复: 3
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

101202139

铜虫 (小有名气)

[求助] 同时表达两种蛋白表达问题

各位虫友，本人最近在做蛋白表达的实验，是将两个目的蛋白基因通过RBS相连接的方式克隆到pET30a表达载体上，用的是较强大的T7启动子，可是跑SDS-PAGE显示只表达了一种蛋白，其中RBS后面的蛋白没有表达，测序也都是正确！不知问题出在哪了？各位有做这种同时表达两种蛋白的吗？你们是通过什么方式同时表达两种蛋白？谢谢……
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

1号文摘

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-04-07 12:49:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖置顶 ( 共有1个 )

lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

amisking: 回帖置顶 2012-04-07 19:03:27
引用回帖:
3楼: Originally posted by 101202139 at 2012-04-07 15:40:05:
我简单的介绍一下采用的两种方法同时表达两种蛋白，用的是pET30a表达载体。方法一：T7启动子+蛋白A的起始密码子，蛋白A的序列，蛋白的终止密码子+RBS+蛋白B的起始密码子，蛋白B的序列，蛋白B的终止密码子。其中R ...

你的方案一有点问题，RBS和蛋白B的起始密码子直接相连没有其余序列，蛋白B没有表达也正常。SD与起始密码子间的这一距离影响翻译起始的效率，最佳的距离约为5-13bp，你从不同的载体图谱上也可以看到这个结论，SD与起始密码子不是紧挨一起的，中间有序列间隔，你去找本分子生物学书仔细看看这部分内容，或者看文献“在大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略”。
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2012-04-07 16:13:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, 鼓励发帖提供有帮助的信息！ 2012-04-07 19:03:18
共表达一般采用两种方式，一种是直接选用共表达载体，然后把两个蛋白基因克隆进去；另外一种就是你说的方法，把两个蛋白基因融合，共用启动子和终止子，在第一个蛋白终止密码子和第二个蛋白起始密码子中间加上RBS序列。
你的情况也没说清楚，比如用的什么酶切位点，RBS和第二个起始密码子的距离等，无法帮你分析为什么不表达。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2012-04-07 13:41:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

101202139

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lxj341401 at 2012-04-07 13:41:41:
共表达一般采用两种方式，一种是直接选用共表达载体，然后把两个蛋白基因克隆进去；另外一种就是你说的方法，把两个蛋白基因融合，共用启动子和终止子，在第一个蛋白终止密码子和第二个蛋白起始密码子中间加上RBS ...

我简单的介绍一下采用的两种方法同时表达两种蛋白，用的是pET30a表达载体。方法一：T7启动子+蛋白A的起始密码子，蛋白A的序列，蛋白的终止密码子+RBS+蛋白B的起始密码子，蛋白B的序列，蛋白B的终止密码子。其中RBS和蛋白B的起始密码子直接相连没有其余序列。
这个方法只表达了RBS序列前的蛋白A，蛋白B没有表达。
方法二：T7启动子+蛋白B的起始密码子，蛋白B的序列，蛋白A的序列，蛋白A的终止密码子。利用这种方法是表达了这种融合蛋白，但是测酶活发现活性很低。我表达蛋白最终是要测酶活的，酶活性太低是在说不过去。我想是不是这两种蛋白这样整合在一起，酶的空间结构发生了变化，如酶的活性中心发生改变。现在我就比较倾向于方法一，只是还搞不明白蛋白B没有表达。不知这样算说明白了吗？谢谢
赞一下 回复此楼
3楼2012-04-07 15:40:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 101202139 的主题更新
41/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 估计是周四 +3 archvillain 2026-08-18 3/150 2026-08-21 01:48 by jnhyjjm
[基金申请] 基金啊基金 +3 longfie172 2026-08-20 3/150 2026-08-21 00:04 by wuchongjun
[基金申请] 科研孤儿太难了 +14 我4大白菜 2026-08-20 15/750 2026-08-20 22:33 by 袁向阳007
[基金申请] 让我中一个面上吧！ +8 大萍1987 2026-08-20 10/500 2026-08-20 21:48 by 大萍1987
[基金申请] 时间戳又变了 +12 wuchongjun 2026-08-20 17/850 2026-08-20 20:05 by spzhao
[基金申请] 今天系统多次维护，明天很可能放榜！ +10 zju2000 2026-08-16 11/550 2026-08-20 20:02 by cl479861084
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +21 yaoyewhu2008 2026-08-20 22/1100 2026-08-20 17:03 by yaoyewhu2008
[基金申请] 放榜前的不淡定 40+3 snowwithsea 2026-08-19 12/600 2026-08-20 15:56 by lfy8008
[基金申请] 重要消息，中午系统在维护 +11 yuleib84 2026-08-18 12/600 2026-08-20 11:09 by xskun
[教师之家] 为什么余额宝的年化利率越来越低？主要原因有哪些？ +5 瞬息宇宙 2026-08-15 5/250 2026-08-19 20:23 by super2002521
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +4 yuleib84 2026-08-19 5/250 2026-08-19 19:52 by hhs666
[基金申请] 今天放榜吗？ +14 布布和一二 2026-08-19 15/750 2026-08-19 18:07 by gltch
[基金申请] 2027广东省杰青 +4 奶牛小黑 2026-08-15 10/500 2026-08-19 11:02 by wanfengnew
[基金申请] 朋友圈看到的 +6 wangzilk 2026-08-18 8/400 2026-08-19 10:55 by Haru815
[基金申请] 快农历七夕节了，轻松一下，男人悄悄话，女施主请不要进来。 +6 Tide man 2026-08-14 7/350 2026-08-19 09:56 by ZJTJZ
[基金申请] 明天放榜？ +5 Shxjjxjkx 2026-08-18 5/250 2026-08-18 18:14 by -大大大大大-
[论文投稿] 投稿咨询 +4 wwm09 2026-08-17 6/300 2026-08-18 15:36 by wwm09
[基金申请] 时间戳又变了8-15 +14 archvillain 2026-08-15 26/1300 2026-08-18 13:37 by phantomgost
[基金申请] 感觉是下周放榜了 +6 angus9576 2026-08-17 11/550 2026-08-17 23:57 by angus9576
[精细化工] 招聘 金属平磨液，抛光液研发工程师 +3 小天0311 2026-08-14 3/150 2026-08-16 07:31 by H9PLUS
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭