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同时表达两种蛋白表达问题
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| 各位虫友，本人最近在做蛋白表达的实验，是将两个目的蛋白基因通过RBS相连接的方式克隆到pET30a表达载体上，用的是较强大的T7启动子，可是跑SDS-PAGE显示只表达了一种蛋白，其中RBS后面的蛋白没有表达，测序也都是正确！不知问题出在哪了？各位有做这种同时表达两种蛋白的吗？你们是通过什么方式同时表达两种蛋白？谢谢…… |
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lxj341401
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4楼2012-04-07 16:13:08
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2楼2012-04-07 13:41:41
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我简单的介绍一下采用的两种方法同时表达两种蛋白，用的是pET30a表达载体。方法一：T7启动子+蛋白A的起始密码子，蛋白A的序列，蛋白的终止密码子+RBS+蛋白B的起始密码子，蛋白B的序列，蛋白B的终止密码子。其中RBS和蛋白B的起始密码子直接相连没有其余序列。 这个方法只表达了RBS序列前的蛋白A，蛋白B没有表达。 方法二：T7启动子+蛋白B的起始密码子，蛋白B的序列，蛋白A的序列，蛋白A的终止密码子。利用这种方法是表达了这种融合蛋白，但是测酶活发现活性很低。我表达蛋白最终是要测酶活的，酶活性太低是在说不过去。我想是不是这两种蛋白这样整合在一起，酶的空间结构发生了变化，如酶的活性中心发生改变。现在我就比较倾向于方法一，只是还搞不明白蛋白B没有表达。不知这样算说明白了吗？谢谢 |
3楼2012-04-07 15:40:05