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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 同时表达两种蛋白表达问题
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101202139

铜虫 (小有名气)

[求助] 同时表达两种蛋白表达问题

各位虫友，本人最近在做蛋白表达的实验，是将两个目的蛋白基因通过RBS相连接的方式克隆到pET30a表达载体上，用的是较强大的T7启动子，可是跑SDS-PAGE显示只表达了一种蛋白，其中RBS后面的蛋白没有表达，测序也都是正确！不知问题出在哪了？各位有做这种同时表达两种蛋白的吗？你们是通过什么方式同时表达两种蛋白？谢谢……
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1楼 2012-04-07 12:49:07
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, 鼓励发帖提供有帮助的信息！ 2012-04-07 19:03:18
共表达一般采用两种方式，一种是直接选用共表达载体，然后把两个蛋白基因克隆进去；另外一种就是你说的方法，把两个蛋白基因融合，共用启动子和终止子，在第一个蛋白终止密码子和第二个蛋白起始密码子中间加上RBS序列。
你的情况也没说清楚，比如用的什么酶切位点，RBS和第二个起始密码子的距离等，无法帮你分析为什么不表达。
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2楼2012-04-07 13:41:41
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101202139

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lxj341401 at 2012-04-07 13:41:41:
共表达一般采用两种方式，一种是直接选用共表达载体，然后把两个蛋白基因克隆进去；另外一种就是你说的方法，把两个蛋白基因融合，共用启动子和终止子，在第一个蛋白终止密码子和第二个蛋白起始密码子中间加上RBS ...

我简单的介绍一下采用的两种方法同时表达两种蛋白，用的是pET30a表达载体。方法一：T7启动子+蛋白A的起始密码子，蛋白A的序列，蛋白的终止密码子+RBS+蛋白B的起始密码子，蛋白B的序列，蛋白B的终止密码子。其中RBS和蛋白B的起始密码子直接相连没有其余序列。
这个方法只表达了RBS序列前的蛋白A，蛋白B没有表达。
方法二：T7启动子+蛋白B的起始密码子，蛋白B的序列，蛋白A的序列，蛋白A的终止密码子。利用这种方法是表达了这种融合蛋白，但是测酶活发现活性很低。我表达蛋白最终是要测酶活的，酶活性太低是在说不过去。我想是不是这两种蛋白这样整合在一起，酶的空间结构发生了变化，如酶的活性中心发生改变。现在我就比较倾向于方法一，只是还搞不明白蛋白B没有表达。不知这样算说明白了吗？谢谢
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3楼2012-04-07 15:40:05
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

amisking: 回帖置顶 2012-04-07 19:03:27
引用回帖:
3楼: Originally posted by 101202139 at 2012-04-07 15:40:05:
我简单的介绍一下采用的两种方法同时表达两种蛋白，用的是pET30a表达载体。方法一：T7启动子+蛋白A的起始密码子，蛋白A的序列，蛋白的终止密码子+RBS+蛋白B的起始密码子，蛋白B的序列，蛋白B的终止密码子。其中R ...

你的方案一有点问题，RBS和蛋白B的起始密码子直接相连没有其余序列，蛋白B没有表达也正常。SD与起始密码子间的这一距离影响翻译起始的效率，最佳的距离约为5-13bp，你从不同的载体图谱上也可以看到这个结论，SD与起始密码子不是紧挨一起的，中间有序列间隔，你去找本分子生物学书仔细看看这部分内容，或者看文献“在大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略”。
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4楼2012-04-07 16:13:08
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