24小时热门版块排行榜    

查看: 2508  |  回复: 9

fanfei211923

铁虫 (初入文坛)

[求助] 大肠杆菌表达42kd的蛋白,蛋白电泳显示只有35kd,测酶活还比较高,这是怎么回事儿呢?

最近表达一个蛋白,大小约为42kd,用载体pET28(a),转入到BL21(DE3)表达,37°C,1mMIPTG诱导后,sds-page电泳结果显示只有在35kd处有明显条带,和理论值差7KD,且条带比较深,用超声破壁测酶活,和文献相比较酶活又比较高,这是怎么回事儿呢,之前一直没有条带,重新连接、转化,才有条带竟和理论值差这么多,真是一波三折啊,希望有经验的虫友们帮小弟解决一下这个难题。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

mitocam

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-24 13:47:41
SDSPage测定蛋白质分子量不是很准,特别如果你的蛋白质有修饰,或含有大量碱性或酸性的氨基酸,或大量的疏水性残基,有大的偏差很正常。
2楼2012-08-24 04:55:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dongniaoxin

铁杆木虫 (正式写手)

响当当的木头

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
为了确定是不是你要的蛋白,你可以做western blot鉴定一下
没有梦就走,没有错就不向谁低头
3楼2012-08-24 08:49:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shxteacher

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-24 13:47:50
你可以<1>导入没有目的基因的空质粒pet28a,看是否有内源表达<2>把你的目的基因中插入终止密码子,看看是否依旧有35kda的蛋白质产生,是否酶活很高
OMG
4楼2012-08-24 09:47:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-24 13:48:02
SDS-PAGE毕竟不是准确的方式,有条件的做质谱,最直观了。
还有就是看看你的蛋白是不是提前终止了。
5楼2012-08-24 09:50:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

101202139

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-25 19:45:43
首先要看看你表达的蛋白是什么类型的?我们实验室出现这样的情况,实际Kd值要比理论小,很有可能是一种糖蛋白!另外,只要你测酶活的方法是正确的,克隆也是正确的,酶活高这不是好事嘛!
6楼2012-08-25 10:12:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

生物-TJAB

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
很有可能啊!理论分子量与表观分子量走了可能差那么多啊!不过还有一种可能就是你的目的基因突变,导致中间形成一个终止密码子,提前终止,导致蛋白变短却有活性。最好打质谱了!准确,放心啊

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
7楼2012-08-26 00:21:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

danlv

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
引用回帖:
5楼: Originally posted by dshlove at 2012-08-24 09:50:54
SDS-PAGE毕竟不是准确的方式,有条件的做质谱,最直观了。
还有就是看看你的蛋白是不是提前终止了。

蛋白翻译是否提前终止应该从DNA序列上就能看出来的吧?  除了遇到同一个ORF里的终止子还有其他可能的情况吗?
8楼2012-08-26 13:39:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ivyvampire

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

不用那么复杂,把插入进去的序列分析清楚,是否有信号肽,被切割之后就短了,不过信号肽貌似不应该有这么长,要么转录进去的序列不对,是截短的序列,要么表达的蛋白转录后被切割了
9楼2012-08-27 14:36:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lintaosong

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

我一般直接做western blot,蛋白电泳看条带不太靠谱,特别对于一些修饰蛋白!
10楼2012-09-02 11:57:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 fanfei211923 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 285求调剂 +3 满头大汗的学生 2026-02-28 3/150 2026-02-28 16:22 by 无际的草原
[考研] 265分求调剂不调专业和学校有行学上就 +4 礼堂丁真258 2026-02-28 6/300 2026-02-28 16:18 by 求调剂zz
[考研] 312求调剂 +4 吃宵夜1 2026-02-28 5/250 2026-02-28 16:11 by gjm133
[考博] 26申博 +3 想申博! 2026-02-26 3/150 2026-02-28 16:07 by nxgogo
[考研] 材料类求调剂 +3 wana_kiko 2026-02-28 3/150 2026-02-28 15:03 by lature00
[考研] 295求调剂 +4 19171856320 2026-02-28 4/200 2026-02-28 13:39 by ms629
[考研] 290求调剂 +4 材料专硕调剂; 2026-02-28 5/250 2026-02-28 13:32 by houyaoxu
[考研] 0856调剂 +3 刘梦微 2026-02-28 3/150 2026-02-28 13:22 by houyaoxu
[考研] 寻找调剂 +3 LYidhsjabdj 2026-02-28 3/150 2026-02-28 12:59 by miniwendy
[考研] 304求调剂 +5 曼殊2266 2026-02-28 6/300 2026-02-28 12:44 by 迷糊CCPs
[硕博家园] 博士自荐 +6 科研狗111 2026-02-26 9/450 2026-02-28 12:32 by seaskyy
[考研] 272求调剂 +3 田智友 2026-02-28 3/150 2026-02-28 12:31 by 王加浩to
[考研] 311求调剂 +3 南迦720 2026-02-28 3/150 2026-02-28 12:24 by houyaoxu
[考研] 280求调剂 +6 Qq206./ 2026-02-21 6/300 2026-02-28 11:20 by 我!要一战成硕
[考博] 博士推荐 +3 花儿笑? 2026-02-21 4/200 2026-02-27 18:30 by 黑!在干嘛
[高分子] 求环氧树脂研发1名 +3 孙xc 2026-02-25 10/500 2026-02-27 13:22 by ichall
[基金申请] 什么是人一生最重要的? +10 瞬息宇宙 2026-02-21 10/500 2026-02-27 08:46 by tfang
[基金申请] 面上可以超过30页吧? +12 阿拉贡aragon 2026-02-22 13/650 2026-02-26 22:09 by Hahaxia
[教师之家] 版面费该交吗 +14 苹果在哪里 2026-02-22 17/850 2026-02-26 11:55 by AGI智创机器人
[硕博家园] 【博士招生】太原理工大学2026化工博士 +4 N1ce_try 2026-02-24 8/400 2026-02-26 08:40 by N1ce_try
信息提示
请填处理意见