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herjasmine

新虫 (初入文坛)

[求助] WB一抗二抗洗脱液洗脱后蛋白有耗损的问题怎么解决？

最近做磷酸化的蛋白，测完磷酸化后要测总蛋白。用一抗二抗洗后，觉得蛋白有耗损。之前按照说明书做过一次，发现耗损比较明显。这次已经降低一半的一抗二抗洗脱时间。但是还是有耗损。想问问各位，做磷酸化后总蛋白都是怎么做到？如果保证总蛋白的量和之前相差不大呢？我把内参同时洗脱了孵的抗体，这样用磷酸化与内参的比值：总蛋白和洗脱后内参的比值可以吗？总蛋白的体积比磷酸化小，我用与内参的比消除这种误差可信吗？谢谢！
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1楼 2013-10-06 15:02:03
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DAX1

新虫 (小有名气)
不是很理解你的意思。你的一抗二抗洗脱应该是同时吧？不知道你们的STRIPPING BUFFER是自己配的还是买的。我用过THERMO（以前PIERCE）的一个缓冲液还是不错的，洗脱肯定会损失蛋白，不过抗总蛋白或者对照一般都不会有问题。而且洗脱的WB膜最好是PVDF。
你后面的问题不是很理解。
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2楼2013-10-06 21:05:33
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herjasmine

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by DAX1 at 2013-10-06 21:05:33
不是很理解你的意思。你的一抗二抗洗脱应该是同时吧？不知道你们的STRIPPING BUFFER是自己配的还是买的。我用过THERMO（以前PIERCE）的一个缓冲液还是不错的，洗脱肯定会损失蛋白，不过抗总蛋白或者对照一般都不会有 ...

也就是说每次用洗脱液洗掉蛋白都是难免的是吗？那如果洗掉了一些蛋白，我洗脱前做的磷酸化，洗脱后损失了一些蛋白做的总蛋白。那么同时用洗脱液洗过的内参，蛋白也会有一定损失。我用洗脱后总蛋白的值/洗脱后内参的值是否可以消除洗脱过程中损失一定蛋白带来的这种影响呢？因为最后还要与磷酸化的蛋白进行比较。
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3楼2013-10-08 21:23:01
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DAX1

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by herjasmine at 2013-10-08 21:23:01
也就是说每次用洗脱液洗掉蛋白都是难免的是吗？那如果洗掉了一些蛋白，我洗脱前做的磷酸化，洗脱后损失了一些蛋白做的总蛋白。那么同时用洗脱液洗过的内参，蛋白也会有一定损失。我用洗脱后总蛋白的值/洗脱后内参的 ...

因为你所谓的比较都是相对的，你的磷酸化抗体或者总蛋白抗体的结合能力肯定是不同的。这就是为什么有的磷酸化的条带比总蛋白的还要强。所以你洗脱损失蛋白不会对你的比较有太大的影响。当然前提是你洗脱的比较均匀，不会有的地方洗脱掉了有的地方没有洗脱掉。
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herjasmine
4楼2013-10-08 21:45:48
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herjasmine

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by DAX1 at 2013-10-08 21:45:48
因为你所谓的比较都是相对的，你的磷酸化抗体或者总蛋白抗体的结合能力肯定是不同的。这就是为什么有的磷酸化的条带比总蛋白的还要强。所以你洗脱损失蛋白不会对你的比较有太大的影响。当然前提是你洗脱的比较均匀 ...

很好！
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5楼2013-10-08 22:12:04
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