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如何提高公司定做的血清抗体的效价~~~~ 已有3人参与
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事情是这样的：我实验室用的抗体是通过公司制作的，来自于小鼠的心脏取血，最近用这个抗体做WB抗我从Hela细胞中提取的总蛋白却抗不出任何条带，怀疑是抗体效价降低的缘故（做了很多对照实验找出问题出在抗体上），希望求助得到能提高抗体效价的办法？？？？？ 之前也看过很多论坛的帖子，总结下来大致提出了两条解决办法： 1、用Protein A/G纯化抗体，然后用Elution Buffer洗脱。 2、将抗原滴在PVDF膜上，用抗原纯化抗体。 看起来很简单，那么问题来了，第一种办法用Elution Buffer洗脱后的抗体能直接用于WB实验吗？第二种办法里并没有说用什么试剂可以将抗体从膜上洗下来，就算找到了试剂能洗脱的，但既然能洗脱必然破坏了抗原和抗体的特异性结合，那么用在洗脱液里的抗体做WB理论上也没法跟抗原结合了啊？？？ 求各位大侠告诉我应该怎么办？ |
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【答案】应助回帖
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1用proteinA/G的洗脱液洗脱的ab，挑PH后可以用于与抗原结合，我纯化的ab就用1M This挑ph到7附近就可以直接用于ELISA了 2洗脱后会发生你说的情况，但及时调整ph或者去除其他变性条件，ab是可以回复的，依然可以用于与ag的结合 至于你WB做不出来的原因，一个可能是目标蛋白含量太低，需要进行一些纯化工作提高含量；一个有可能是因为目标蛋白经过PAGE，蛋白变性，构型改变导致ab不能识别，可以用纯的蛋白做WB测试一下是不是这个原因。 发自小木虫Android客户端 |
2楼2015-08-28 18:10:44
3楼2015-08-28 22:45:02
4楼2015-08-28 22:47:55
【答案】应助回帖
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SDS-PAGE中会有很多因素导致蛋白变形，比如加热、SDS、巯基乙醇。你应当先验证是不是这个原因，再考虑非变性电泳。至于非变性电泳，你跟网上搜native PAGE就有，我NATURE PROTOCOL有详细的步骤。 发自小木虫Android客户端 |
5楼2015-08-28 23:00:49
6楼2015-08-28 23:02:21
7楼2015-08-28 23:05:29
hc-material
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【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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一般四中可能，虽然我没做WB。 1.人，你做了很多对照实验问题出在抗体上，而这个抗体是别的公司制作的，就是商品，商品不合格你先找制作的公司，让他们跟你提高效价，当然前提确实是抗体有问题，而不是你的对照实验过程有问题。 2.你做WB时的环境，比如无菌啊，环境温度啊，酸碱环境啊，有无还原剂啊，有无是蛋白变性的物质啊。环境是否存在污染物。 3.你做WB的实验方法是否是正确合理的，包括你验证抗体的实验，方法不对，有好的结果的可能性不大，也包括你提总蛋白的方法。 4.你用的抗体有问题或者你提取Hela细胞中总蛋白，提取出来时已经失活变性了，还有包括你验证的实验用的蛋白是否有活性。若你验证的材料方法有问题，那很难说明是抗体有问题。当然相信你验证的方法材料没问题。 那么问题来了，既然是抗体的问题，抗体有是买的商品，那直接找供货方，你要自己处理，方法你也知道啊，那先试验啊，看结果。 综上所述，抗体效价不够，出问题的可能性不大，方法材料出问题的可能性比较大。祝顺利。 |
8楼2015-08-29 20:11:54
9楼2015-08-29 21:40:57
10楼2015-08-29 21:45:14
