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[求助]
如何提高公司定做的血清抗体的效价~~~~ 已有3人参与
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事情是这样的：我实验室用的抗体是通过公司制作的，来自于小鼠的心脏取血，最近用这个抗体做WB抗我从Hela细胞中提取的总蛋白却抗不出任何条带，怀疑是抗体效价降低的缘故（做了很多对照实验找出问题出在抗体上），希望求助得到能提高抗体效价的办法？？？？？ 之前也看过很多论坛的帖子，总结下来大致提出了两条解决办法： 1、用Protein A/G纯化抗体，然后用Elution Buffer洗脱。 2、将抗原滴在PVDF膜上，用抗原纯化抗体。 看起来很简单，那么问题来了，第一种办法用Elution Buffer洗脱后的抗体能直接用于WB实验吗？第二种办法里并没有说用什么试剂可以将抗体从膜上洗下来，就算找到了试剂能洗脱的，但既然能洗脱必然破坏了抗原和抗体的特异性结合，那么用在洗脱液里的抗体做WB理论上也没法跟抗原结合了啊？？？ 求各位大侠告诉我应该怎么办？ |
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4楼2015-08-28 22:47:55
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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1用proteinA/G的洗脱液洗脱的ab，挑PH后可以用于与抗原结合，我纯化的ab就用1M This挑ph到7附近就可以直接用于ELISA了 2洗脱后会发生你说的情况，但及时调整ph或者去除其他变性条件，ab是可以回复的，依然可以用于与ag的结合 至于你WB做不出来的原因，一个可能是目标蛋白含量太低，需要进行一些纯化工作提高含量；一个有可能是因为目标蛋白经过PAGE，蛋白变性，构型改变导致ab不能识别，可以用纯的蛋白做WB测试一下是不是这个原因。 发自小木虫Android客户端 |
2楼2015-08-28 18:10:44
3楼2015-08-28 22:45:02
【答案】应助回帖
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SDS-PAGE中会有很多因素导致蛋白变形，比如加热、SDS、巯基乙醇。你应当先验证是不是这个原因，再考虑非变性电泳。至于非变性电泳，你跟网上搜native PAGE就有，我NATURE PROTOCOL有详细的步骤。 发自小木虫Android客户端 |
5楼2015-08-28 23:00:49